BRET方法研究BST-2和HIV-1Vpu相互作用及小分子化合物抑制剂的筛选

摘要

宿主限制因子是由宿主细胞产生，通过影响病毒复制周期的不同环节，从而抑制病毒复制与传播的一类细胞蛋白，是宿主防御病毒侵袭的一道屏障。而病毒在进化过程中也产生相应的策略来克服这些屏障。因此宿主与病毒之间的相互作用近年来成为病毒学领域的研究热点。BST-2（又称HM1.24，tetherin或CD317）是宿主体内抑制囊膜病毒释放的限制因子，它的抗病毒作用可被HIV-1的辅助蛋白Vpu所拮抗，这种拮抗作用由二者跨膜区的相互作用介导，但BST-2和Vpu跨膜区相互作用的具体分子机制还仍在继续探索中，为此，我们应用生物发光共振能量转移(BRET)方法，在活细胞内重现BST-2和Vpu之间的相互作用，同时将两种蛋白质的整个跨膜区分别进行联合及单点突变，通过BRET信号的变化鉴定出它们相互作用的关键氨基酸位点，并验证这些影响相互作用的关键位点也影响了Vpu对BST-2的拮抗作用。同时，我们基于BRET方法建立了BST-2和Vpu在细胞内稳定共表达的细胞系，并将其作为一种高通量筛选工具，针对两种蛋白质跨膜区相互作用这样一个潜在的药物靶标，筛选出了小分子化合物抑制剂PR，并对其进行了初步的功能验证。具体研究结果如下:
　　 一.BST-2和Vpu跨膜区相互作用关键氨基酸位点的鉴定
　　 我们首先将BST-2和Vm(Vpu S52，56A)的N端或C端与生物发光共振能量转移的供体蛋白Renilla luciferase(Rluc)或受体蛋白EYFP融合构建，按不同组合（包含供体蛋白和受体蛋白）在293T细胞内共表达后，检测BRET信号，发现N端融合Rluc的BST2（Rluc-BST2）和C端融合EYFP的Vm(Vm-EYFP)共表达后产生与阳性对照相当的BRET信号，从而确定应用于此研究的最佳组合为Rluc-BST2和Vm-EYFP，并通过饱和实验和竞争实验验证BRET方法在研究BST-2和Vpu相互作用中的特异性。而后将两种蛋白质跨膜区分别进行突变，转染293T细胞后，检测BRET信号的变化。我们发现，BST-2的I34、L37、P40和L41，以及Vpu的L11、A18和W22位点突变后，BRET比值明显降低，说明这些位点为BST-2和Vpu相互作用的关键位点。其中，BST-2的P40位点以及Vpu的L11位点为我们首次发现。另外，我们还发现Vpu跨膜区三位氨基酸联合突变体14-16(AⅡ-VAA)和26-28(ⅡE-AAA)能明显降低BRET信号，但将该范围内的氨基酸进行单点突变后却并未发现上述现象。我们将首次鉴别出的这些氨基酸突变体进行了分子动力学模拟分析，发现这些突变体明显改变了BST-2和Vpu跨膜区复合物的构象，从而影响了两种蛋白质的相互作用。功能实验证实了这些关键氨基酸位点的突变影响了Vpu拮抗BST-2抗病毒作用的能力。
　　 二.小分子化合物抑制剂的筛选和初步功能验证
　　 将质粒Rluc-BST2和Vpu-EYFP构建到一种双表达载体中，并利用构建的双表达质粒，建立了Rluc-BST2和Vpu-EYFP稳定双表达的293细胞系，将此细胞系作为筛选模型，以BST-2和Vpu之间的相互作用为靶点，对小分子化合物进行了筛选。以BRET信号降低作为筛选阳性指标。经过对12000种小分子化合物的筛选，初步筛选出了27种阳性化合物。经过后期的功能验证排除了大部分化合物，最终确定了一种化合物PR作为最终的筛选阳性结果。初步功能验证发现该种化合物能特异性恢复细胞内BST-2的表达水平，进而抑制病毒的释放。即化合物PR能通过干扰BST-2和Vpu之间的相互作用，从而影响Vpu对BST-2抗病毒功能的拮抗，恢复BST-2固有的限制因子活性。
　　 综上所述，本研究首次应用BRET技术在活细胞内对BST-2和Vpu之间的相互作用进行了研究，鉴定出了BST-2和Vpu跨膜区相互作用的关键氨基酸位点。并以此技术为基础首次创立了以BST-2和Vpu之间的相互作用为明确靶点的小分子化合物抑制剂筛选模型，并对筛选出的阳性化合物进行了初步功能验证。本研究结果对进一步阐明BST-2和Vpu之间的相互作用机制提供了可靠的研究数据，为抗HIV-1药物的筛选提供了新途径，以及对将来抗HIV-1药物的研发提供了新的候选。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 BRET方法研究BST-2和HIV-1 Vpu相互作用

前言

材料与方法

一．实验材料

二．实验方法

结果

1．BRET体系的建立

2．BRET方法特异性的验证

3．BST-2跨膜区与HIV-1 Vpu相互作用关键氨基酸位点的鉴定

4．HIV-1 Vpu跨膜区与人BST-2相互作用关键氨基酸位点的鉴定

5．分子动力学模拟

6．关键氨基酸位点突变后的功能验证

讨论

小结

第二部分 小分子化合物抑制剂的筛选及功能验证

前言

材料和方法

一．实验材料

二．实验方法

结果

1．筛选模型的建立

2．小分子化合物抑制剂的筛选

3．筛选阳性化台物的作用验证

讨论

小结

结论

参考文献

致谢

个人简历

博士期间发表论文