多药耐药基因1(Abcb1)敲除和人源化大鼠模型的建立&AhR人源化大鼠模型的建立及TCDD对AhR人源化大鼠的急性毒性分析

摘要

第一部分多药耐药基因1(Abcb1)敲除和人源化大鼠模型的建立
　　目的: P-糖蛋白是由多药耐药基因1(Abcb1)编码的蛋白质，它与血脑屏障及其他组织的药物转运密切相关，且与肿瘤细胞的多药耐药性密切联系。目前尚无合适的用于评价药物透过血脑屏障以及药物进入肿瘤细胞的实验动物模型，而本研究首先敲除大鼠Abcb1基因，并在Abcb1基因敲除大鼠的基础上建立了Abcb1人源化大鼠模型，为相关药物代谢和药物评价研究提供了更接近人类Abcb1基因功能的动物模型。
　　方法:利用大片段转基因技术构建BAC-Abcb1，通过显微注射的方法将人源Abcb1转入到大鼠体内，建立hAbcb1转基因大鼠。利用CRISPR/Cas9技术设计构建sgRNA，通过显微注射的方法将其转入大鼠体内，建立Abcb1b基因敲除大鼠。通过杂交培育获得杂交大鼠，并利用PCR、测序分析、RT-PCR和Real-time PCR的方法对杂交大鼠进行鉴定及表达分析，筛选获得Abcb1人源化大鼠。
　　结果:将包含人源Abcb1启动子和cDNA的153kb BAC片断转入到大鼠基因组，建立了稳定表达h-Abcb1的转基因大鼠，同时建立了Abcb1基因敲除大鼠，将两者杂交筛选获得Abcb1人源化大鼠模型。人源化大鼠不仅表达h-Abcb1基因，在组织表达谱方面也与人类更接近。
　　结论:建立了Abcb1基因敲除大鼠和人源化大鼠模型，为相关药物代谢和药物评价研究提供了更接近人类Abcb1基因功能的动物模型。
　　第二部分 AhR人源化大鼠模型的建立以及TCDD对AhR人源化大鼠的急性毒性分析
　　目的:芳香烃化合物受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是四氯二苯并-p-二恶英(TCDD)等多环卤代化合物对机体产生毒性和致癌性中主要参与者，同时在机体正常组织发育中也担当重要功能。由于不同物种对TCDD的敏感性不同，目前尚无合适的用于评价TCDD类环境污染物对人体毒性的实验动物模型，而且对AhR基因功能的研究也需要进一步的探索。
　　本研究通过敲除大鼠AhR基因，建立AhR基因敲除动物模型，用作研究AhR基因功能，并在基因敲除大鼠的基础上建立AhR人源化大鼠模型，为AhR相关药物毒物代谢和药物评价研究提供更接近人类的动物模型。
　　方法:利用大片段转基因技术构建BAC-AhR，通过显微注射的方法将人源的AhR转入到大鼠体内，建立hAhR转基因大鼠。利用CRISPR/Cas9技术设计构建sgRNA，通过显微注射的方法将其其转入大鼠体内，建立AhR基因敲除大鼠。通过杂交培育的方法获得AhR人源化大鼠。利用PCR、测序分析、RT-PCR、Real-time PCR和Western blot的方法对三种大鼠进行鉴定及分析。野生型大鼠、AhR基因敲除大鼠以及AhR人源化大鼠单次腹腔注射给予TCDD，通过观察给药后动物一般情况、血生化指标、主要脏器脏器系数及病理改变，比较三种大鼠对TCDD的敏感性差异，从而研究人体对TCDD的敏感性。
　　结果:将包含人源AhR基因的162kb BAC片断转入到大鼠基因组，获得稳定表达h-AhR基因的大鼠，同时建立了AhR基因敲除大鼠。通过将两者杂交筛选获得AhR人源化大鼠模型。人源大鼠与野生大鼠AhR表达谱有明显的区别，AhR人源化大鼠不仅表达h-AhR基因，在组织表达谱方面也与人类更接近。AhR基因敲除大鼠和AhR人源化大鼠对TCDD的敏感性低于野生型大鼠，AhR在心脏、肝脏、肺和胸腺发育过程可能扮演重要角色。
　　绪论:建立了AhR基因敲除大鼠和人源化大鼠模型，AhR基因敲除动物可作为AhR基因功能研究的模型，AhR人源化模型可作为AhR基因相关药物毒物代谢研究更接近人类的动物模型。

目录

第一部分 多药耐药基因1(Abcb1)敲除和人源化大鼠模型的建立

摘要

前言

1．1 P-糖蛋白的分布及功能

1．2 药物毒性预测

1．3 人源化动物模型

1．4 大鼠在动物桢型中的应用

材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

结果

3．1 hAbcb1-BAC转基因大鼠的制备与分析

3．2 Abcb1b基因敲除大鼠的制备

3．3 Abcb1人源化大鼠的培育

3．4 Abcb1人源化大鼠和人及野生型大鼠Abcb1b表达情况对比分析

讨论

结论

参考文献

第二部分 AhR人源化大鼠模型的建立以及TCDD对AhR人源化大鼠的急性毒性分析

摘要

前言

1．1 AhR的分布与功能

1．2 人源化动物应用的必要性

材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

结果

3．1 hAhR-BAC转基因大鼠的制备与分析

3．2 AhR基因敲除大鼠的制备

3．3 AhR人源化大鼠的培育

3．4 Western blot检测AhR蛋白及CYP1A1／2蛋白表达情况

3．5 AhR人源化大鼠和野生型大鼠及人AhR表达情况对比分析

3．6 给药后大鼠的一般体征观察

3．8 TCDD对血生化的影响

3．9 TCDD对肝脏、肾脏和肺病理学结构的影响

讨论

结论

参考文献

英文缩略语表

个人简历

致谢

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