第一部分基因特异性单核苷酸变异与前列腺癌患病风险的关联研究；第一部分中国人前列腺癌新融合基因的初步研究

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第一部分 基因特异性单核苷酸变异与前列腺癌患病风险的关联研究
　　第一节 基因特异性单核苷酸变异与前列腺癌发生关联的系统Meta分析
　　目的：用Meta分析的方法系统地研究基因特异性单核苷酸变异与多人群前列腺癌患病风险的关联。
　　材料：检索1990年8月1日至2015年8月1日收录于PubMed、EMBASE和Cochrane Library大型数据库中关于单核苷酸变异(SNVs)与PCa发生关联的研究文献。制定文献纳入和排除标准，并进行文献筛选。采取双人盲法提取文献数据。所有数据的Meta分析采用Comprehensive meta-analysis v2.0软件完成分析。首先采用Q检验分析各研究之间的异质性，根据是否存在研究异质性分别采用Mantel-Haenszel固定效应模型或DerSimonian and Laird随机效应模型合并效应量，计算单核苷酸变异(SNVs)与PCa发生的OR值和95％ CI。其次分析研究异质性产生的可能原因;接下来通过敏感性分析和累积分析评价Meta分析结果的稳定性。其后采用Egger's回归检验、绘制漏斗图以及Duvaland Tweedie's分析评估潜在发表偏倚。最后，利用Gene set enrichmentanalysis软件进行生物学信息分析，剖析阳性关联基因潜在富集的信号通路和生物学过程。
　　结果：共计检索到相关文献超过40，000篇。根据纳入排除标准，最后有560篇文献进入Meta分析。这些文献报道了超过3个独立研究的51个基因的66个单核苷酸变异位点。入组总的样本量1，002，493，每个SNV的文献数3-33个。66个Meta分析中，总共有20个基因特异性SNVs与前列腺癌发病风险显著关联。这些关联位点分别位于19个不同的基因（KLK3，IGFBP3，ESR1，SOD2，CAT,CYP1B1，VDR,RFX6,HNF1B,SRD5A2,FGFR4,LEP,HOXB13,FAS,FOXP4,SLC22A3,LMTK2,EHBP1及MSMB)，涉及的病例-对照总人数为584，100人。其中，风险等位基因的平均OR值为1.33(1.016-3.788)，保护性等位基因的平均OR值为0.838(0.757-0.896)。
　　结论：本课题对过去25年发表的基因特异性单核苷酸变异与前列腺癌发生的关联研究进行系统性的Meta分析。结果显示有20个变异位点与前列腺癌显著性关联，然而多数位点的遗传效应（OR值）小，因此阳性结果的解释应该慎重，部分阳性位点的关联还需在扩大的样本群体中进行验证，并深入探讨这些遗传位点在PCa发生中的生物学功能。
　　第二节 单核苷酸变异与中国汉族人群前列腺癌患病风险的关联研究
　　目的：研究单核苷酸变异(SNVs)与中国汉族人群前列腺癌(PCa)患病风险的关系。
　　材料：回顾性分析中国汉族PCa患者826例和按年龄匹配的健康男性975例，记录受试者临床信息并用酚氯仿法提取外周血基因组DNA。利用荧光标记引物PCR扩增包含变异位点的片段，高分辨熔解曲线(HRM)对SOD2 rs4880、MPOrs2333227和LEP rs2167270进行基因分型，然后用Sanger测序验证分型结果。比较基因型频数在PCa组和对照组的分布差异，并用Logistic regression分析变异携带的风险等位基因与PCa患者年龄、前列腺特异抗原(PSA)、Gleason评分和临床病理分期的关系。两组基因型频率分布差异的比较采用x2检验，计算比值比(OR)及其95％置信区间(95％CI)，P＜0.05认为具有统计学意义。统计学分析采用PLINK V1.02及SPSS16.0软件完成。本研究的关联结果与既往不同人群中的关联结果采用Comprehensive meta-analysis v2.0软件进行汇总分析。
　　结果：最终纳入具有完整临床资料和基因分型结果的研究对象共1445例，PCa组504例，对照组941例。两组受试者的年龄无显著性差异（P＞0.05）。SOD2rs4880基因型CC在Recessive model PCa患者中的携带频率明显高于对照组中的携带频率(OR=2.929，95％CI=1.56-5.51，P=0.0005)。MPO rs2333227 TT+CT基因型在Dominant model中两个群体间有显著的统计学差异(OR=1.286，95％CI=1.03-1.61，P=0.029)， T等位基因的携带频率在Allelic model有统计学差异(OR=1.268，95％CI=1.04-1.55，P=0.019)。LEP rs2167270的G等位基因和基因型的频率分布分析均未见统计学差异。各单核苷酸变异在不同年龄、PSA和临床病理分期的PCa患者中分布无显著性差异（P＞0.05）。
　　结论:SOD2 rs4880 C＞T与中国汉族人群前列腺癌的发生显著关联，T等位基因的携带增加前列腺的发病风险。MPO rs2333227 T为中国汉族人群前列腺癌发生的保护性等位基因尚需进一步证实。
　　第二部分 中国人前列腺癌新融合基因的初步研究
　　目的：初步识别中国人前列腺癌中的新融合基因。
　　材料：9对TMPRSS2-ERG阴性的中国北方汉族PCa患者的前列腺癌组织及其癌旁组织提取总RNA，逆转录获得cDNA并建立RNA-Seq文库，经HiSeq2000高通量测序，利用Soap软件进行数据读取和融合基因的判读，筛选出前列腺癌表达的新的融合基因，通过RT-PCR和Sanger测序在前列腺癌组织中验证融合基因，并识别其融合形式。
　　结果：9对前列腺癌及癌旁组织的RNA-Seq数据经Soap软件分析后共识别58个融合基因，其中33个在前列腺癌组织表达，根据测序reads的覆盖深度和位置，筛选出4个融合基因进行RT-PCR和Sanger测序验证。3个前列腺癌新融合基因ETV3-CRB1，GTF2I-LIMK1及REPS2-TXLNG及其融合形式被确定。
　　结论：识别3个新的前列腺癌融合基因。

目录

缩略词表

摘要

第一部分 基因特异性单核苷酸变异与前列腺癌患病风险的关联研究

第一节 基因特异性单核苷酸变异与前列腺癌发生关联的系统Meta分析

引言

1 资料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二节 单核苷酸变异与中国汉族人群前列腺癌患病风险的关联研究

引言

1 实验材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分 中国人前列腺癌新融合基因的初步研究

引言

1 材料与方法

1．1 研究对象

1．2 实验仪器及试剂

1．3 实验方法

2 结果

2．1 总RNA质量检测结果

2．2 全转录组mRNA的测序数据质量评估

2．3 融合基因的识别

2．4 前列腺癌组织表达的融合基因的验证

3 讨论

4 结论

参考文献

文献综述

致谢

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