一株1型单纯疱疹病毒参考株的建立及特性分析

摘要

1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV1)是疱疹病毒科α病毒亚科的一员，能引起多种疾病，包括龈口炎，病毒性脑炎，角膜结膜炎等，能够感染多种细胞并在体内感染中建立潜伏感染。针对HSV感染目前还没有疫苗和完全清除体内病毒的药物被研发出来。此外，HSV由于其具有大型环状DNA和神经潜伏感染的特征，在研究神经系统疾病时可以作为载体而得到广泛的应用。
　　本研究中从临床病人口唇部疱液分离得到一株病毒，通过Vero细胞扩增纯化，通过PCR分析、电镜鉴定确定该病毒为1型HSV，命名为HSV1-ZW6，对其进行病毒增值特性分析，包括对其感染不同细胞病变形态学分析、一步生长曲线的绘制、小鼠神经毒力检测试验等，结果提示此分离株与实验室传代毒株HSV1-8F相比，其神经毒力略高于HSV1-8F。利用高通量测序技术对此株病毒基因组进行了测序，联合Sanger测序对其进行修补，最终获得了150290bp的病毒全基因组序列，并通过对全基因进行基因预测和注释获得其全基因组结构图，选取部分基因进行亲缘关系进化树绘制和简单重复序列分析，发现位于IRL/TRL区的一段32个A/T重复的特征序列。根据已知序列，利用CRISPR-Cas9技术快速获得了一株带有绿色荧光蛋白的重组病毒ZW6-EGFP。此外，本研究在建立了二倍体细胞KMB17细胞代次与端粒长度变化模型的基础上，在细胞水平检测了单纯疱疹病毒感染KMB17细胞后，对感染后端粒长度的影响，初步发现HSV1感染KMB17细胞后会对其产生影响，而感染癌细胞或永生化细胞系则未发现相似结果。
　　通过对HSV1的分离、鉴定及全基因组测序完成，本研究建立了一株新的HSV1参考株及其相应的报告病毒，利用该病毒研究病毒与细胞之间的相互作用进行了初步探索，更多的生物特性还有待进一步的深入研究。

目录

摘要

第一部分 1型单纯疱疹病毒的分离鉴定及增殖特性分析

1 前言

2 实验材料

2．1 细胞

2．2 引物序列

2．3 试剂及耗材

2．4 实验动物

2．5 仪器设备

3 实验方法

3．1 细胞培养

3．2 病毒分离

3．3 病毒蚀斑纯化

3．4 病毒PCR鉴定

3．5 病毒的电镜观察

3．6 病毒滴度测定

3．7 病毒在不同细胞增殖特性

3．8 病毒生长曲线测定

3．9 动物神经毒力实验

4 实验结果

4．1 病毒的噬斑纯化

4．2 病毒PCR检测

4．3 病毒电镜结果

4．4 病毒在不同细胞病交情况

4．5 病毒感染不同细胞生长曲线测定

4．6 动物神经毒力实验

5 实验讨论

第二部分 低代次1型疱疹病毒全基因组测序及初步分析

1 前言

2 实验材料

2．1 病毒株和细胞

2．2 引物序列

2．3 主要参考序列

2．4 序列分析软件及在线分析系统

3 实验方法

3．1 病毒全基因组提取

3．2 基因组限制性片段长度多态性分析

3．3 病毒全基因组的二代测序

3．4 病毒全基因组的修补

3．5 病毒全基因组序列的组装及提交

3．6 病毒全基因组分析

4 实验结果

4．1 病毒基因组提取及限制性片段长度多态性分析

4．2 基因组Illumina测序结果

4．3 基因组的PCR缺口修补

4．4 病毒基因组基因预测

4．5 病毒基因组结构

4．6 病毒的点阵分析

4．7 进化树的构建

4．8 病毒基因组简单重复序列分析

5 实验讨论

第三部分 基于CRISPR-Cas9技术的重组单纯疱疹病毒的构建

1 前言

2 实验材料

2．1 病毒株及细胞

2．2 质粒

2．3 引物序列

3 实验方法

3．1 细胞转染

3．2 病毒感染

3．3 病毒的噬斑纯化

3．4 PCR检测病毒TK基因

4 实验结果

4．1 Cas9诱导的病毒基因组同源重组

4．2 重组病毒的噬斑纯化及TK基因检测

第四部分 HSV1与端粒长度变化的细胞模型建立的初步研究

1 前言

2 实验材料

2．1 病毒株和细胞

2．2 引物序列

3 实验方法

3．1 病毒感染

3．2 病毒感染后细胞端粒长度测定

4 实验结果

4．1 端粒长度PCR产物琼脂糖凝胶电泳

4．2 标准曲线绘制

4．3 KMB17随传代次数增加端粒缩短

4．4 病毒感染对细胞端粒影响

5 实验讨论

实验小结

参考文献

附录

致谢

研究生简历

声明