酿酒酵母异源表达植物乳杆菌素防控乙醇发酵中乳酸菌污染

摘要

随着化石能源的迅速开采和耗竭，以及大气污染、温室效应、雾霾天气等环境问题的日益凸显，人们对可再生清洁能源的需求日益迫切。生物乙醇以其环保、能效高、可再生等优势受到各国专家学者的追捧。
　　目前，围绕着生物乙醇的非粮原料利用、酵母乙醇耐受性、杂菌污染防控等方面的研究正在广泛展开。其中，由于仪器渗漏、种子带菌等难以避免的问题，杂菌污染在工业规模生物乙醇发酵中经常发生，若得不到有效控制，将会严重影响乙醇产量，从而造成巨大的经济损失。前人研究表明，乳酸菌因其耐低pH值、耐乙醇及高增殖速率等特点成为生物乙醇发酵中的主要污染菌，其主要通过主要通过分泌乳酸以及与酿酒酵母竞争营养物质和生存空间抑制酵母菌生长和乙醇终产量。针对其生理生化特性人们摸索出一系列方法抑制乳酸菌污染，其中最为广泛使用的是抗生素法。抗生素具有控制染菌效率高、成本低廉、杀灭彻底等优势，然而其过度使用存在着药物残留、耐药性等多方面问题。随着人们对环境问题的关注，寻找环境友好的、可替代抗生素的杂菌防控方法迫在眉睫。
　　本课题将植物乳杆菌ATCC8014作为污染杂菌，将其与酿酒酵母S288c共培养，以建立生物乙醇发酵的人工模拟染菌体系;利用提取自植物乳杆菌ATCC BAA-793培养上清液的的乳杆菌素对酿酒酵母发酵过程中植物乳杆菌ATCC8014的污染进行防控。通过测定发酵过程中植物乳杆菌ATCC8014和酿酒酵母S288c的生物量以及发酵终期的乙醇浓度探究植物乳杆菌素抑菌效果。结果显示植物乳杆菌素对ATCC8014具有很好的抑制作用，并且植物乳杆菌素处理组S288c的生物量和发酵终期的乙醇浓度均恢复到染菌前水平（与对照组相比，P＞0.05;与染菌组相比，P＜0.05）。此外，本课题在酿酒酵母S288c培养初始阶段添加植物乳杆菌素，通过测定发酵过程中S288c的生物量和发酵终期的乙醇浓度评价其安全性，结果显示植物乳杆菌素自身对酿酒酵母发酵无毒副作用。
　　本课题以酿酒酵母InvScI为宿主，将plantricinA(plnA)、plantricinE(plnE)、plantricinF(plnF)三种植物乳杆菌素的编码基因分别通过载体pYES2转入酿酒酵母，构建可分泌表达目的片段的工程菌InvScI-plnA、InvScI-plnE、InvScI-plnF。分别利用半乳糖诱导其表达植物乳杆菌素plnA、plnE、plnF，结果显示其上清液对指示菌ATCC8014有明显的抑菌活性。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 工业化生产乙醇

1．2 生物乙醇发酵过程的染菌问题

1．2．1 生物乙醇发酵染菌的原因及危害

1．2．2 生物乙醇发酵染菌的主要菌种

1．3 生物乙醇发酵染菌的防控方法

1．3．1 传统的染菌防控方法——抗生素抑菌法

1．3．2 其他染菌防控方法

1．4 乳酸菌细菌素

1．4．1 乳酸菌素的应用

1．4．2 乳酸菌素的异源表达

1．4．3 植物乳杆菌素研究进展

1．5 本课题的研究意义和主要研究内容

1．5．1 课题研究的意义

1．5．2 本课题的主要研究内容

第二章 植物乳杆菌素的抑菌测定

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌种

2．2．2 培养基

2．3 实验方法

2．3．1 植物乳杆菌素粗品的制备

2．3．2 植物乳杆菌素的浓度优化

2．3．3 植物乳杆菌素的抑菌效果评价

2．3．4 植物乳杆菌素的副作用评价

2．4 实验结果

2．4．1 植物乳杆菌素粗品的抑菌圈实验

2．4．2 植物乳杆菌素浓度优化

2．4．3 植物乳杆菌素抑菌效果评价

2．4．4 植物乳杆菌素副作用评价

2．5 小结

第三章 plnA、plnE、plnF在大肠杆菌中异源表达

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌种及载体

3．2．2 主要试剂

3．3 实验方法

3．3．1 目的基因的钓取与保存

3．3．2 目的基因表达

3．4 实验结果

3．4．1 plnA／E／F钓取保存

3．4．2 目的基因plnA、plnE、plnF表达

3．5 小结

第四章 酿酒酵母工程菌的构建

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌种与载体

4．2．2 主要试剂

4．2．3 培养基

4．3 实验方法

4．3．1 质粒构建

4．3．2 酵母转化

4．3．3 酿酒酵母工程菌产物表达及抑菌效果验证

4．4 实验结果

4．4．1 质粒构建

4．4．2 酵母转化

4．4．3 抑菌效果验证

4．5 小结

第五章 结论与建议

5．1 主要结论

5．2 建议

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间的研究成果

作者和导师介绍