基于NBD-胺裂解反应的溶酶体定位探针和近红外探针的开发及发展蛋白Tyr和His标记方法

摘要

荧光方法，由于其高灵敏性、适合于高通量筛选、能够被用于活细胞成像等优点，已经成为“可视化”生命过程的首选方法。发展生物荧光标记技术是实现生命过程“可视化”的重要手段之一。生物荧光标记的共性问题是发现和利用具有生物选择性和相容性的有效化学反应对目标生物分子进行荧光标记。生物体系存在着不同种类的分子，它们的化学性质各异，因此需要针对性的发展特定的生物荧光标记技术。本文针对H2S和蛋白质，发展了新型生物荧光标记反应和方法:
　　(1)基于NBD-胺裂解反应设计合成了一个基于FRET效应的用于可视化溶酶体中H2S的比例计量型新型探针。探针具有良好的水溶性，对H2S具有明显的从黄色到蓝色的发射荧光响应，并对H2S具有高度选择性。探针也具有良好的生物相容性，可用于检测溶酶体内的H2S。该探针验证了基于FRET效应设计细胞器定位比例型计量H2S探针策略的可行性。
　　(2)基于NBD-胺裂解反应设计合成了一个用于检测小鼠体内直肠癌细胞内源性H2S的新型近红外探针。探针与H2S在缓冲溶液(pH7.4)反应后在796nm发射峰（激发为730nm）处有87倍的荧光增强。探针具有良好的水溶性、细胞膜通透性、低细胞毒性及对H2S具有高度选择性和灵敏度。这些性质使探针适合于检测活细胞、组织和小鼠体内的内源性H2S。生物成像得到的主要结果为:(a)D-Cys可以诱导活细胞产生H2S并促进血管再生;(b)向小鼠尾部静脉注射探针其肝脏会产生强荧光，而腹部注射D-Cys会进一步增强肝脏中的荧光;(c)更重要的是通过肿瘤内注射探针可以快速和灵敏地检测体外直肠癌细胞（HCT116和HT29）和小鼠肿瘤模型内的内源性H2S。这些结果表明该探针可以作为检测活体动物细胞内H2S的有用工具，并且有望用于癌症诊断。
　　(3)通过以PF6-作为阴离子，对Tyr的标记发展了一系列稳定的重氮盐标记试剂。这些试剂分别可以在Tyr的侧链引入酮基、炔基和四嗪基团，再通过相应的生物正交反应实现了蛋白质和TMV的标记。另外还设计了一个两端为重氮基团的交联分子，计划用其制备TMV基水凝胶。电泳和电镜结果显示该交联试剂可以较好地交联TMV。还首次提出将Chan-Lam反应应用到His的标记中，优化了Chan-Lam反应在水溶液中进行的条件及测试了对咪唑基团的选择性，并成功地实现蛋白质的荧光单标记和双标记。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1．2 硫化氢荧光探针的设计策略

1．1．3 NBD基探针简介

1．1．4 细胞器定位硫化氢探针

1．1．5 近红外硫化氢探针

1．2 蛋白质修饰

1．2．1 基于天然氨基酸侧链的修饰

1．2．2 基于非天然活性基团的修饰

1．3 生物正交反应

1．3．1 醛／酮与胺的缩合反应

1．3．2 叠氮-炔基环加成

1．3．3 四嗪参与的连接反应

1．4 病毒基材料

1．4．1 病毒基纳米材料

1．4．2 病毒基水凝胶

1．4．3 烟草花叶病毒

1．5 本文的研究目标和内容

第二章 基于NBD-胺裂解反应的溶酶体定位硫化氢探针

2．2 实验材料和器材

2．3 实验方法与过程

2．3．1 合成

2．3．2 探针1的溶解度测试

2．3．5 探针1的选择性测试

2．3．6 探针1的检测极限测定

2．3．7 细胞测试

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 探针1的溶解度

2．4．2 探针1与H2S反应过程

2．4．3 探针1与H2S反应的荧光光谱

2．4．4 探针1的选择性

2．4．5 探针1的细胞毒性

2．4．6 细胞成像

2．5 本章总结

第三章 基于NBD-胺裂解反应的近红外硫化氢探针

3．1 背景介绍与研究思路

3．2 实验材料和器材

3．3 实验方法与过程

3．3．1 合成

3．3．2 探针7的溶解度测试

3．3．3 探针7与H2S反应的紫外-可见光谱测试

3．3．4 探针7相关性质的荧光光谱测试

3．3．5 探针7与H2S反应的荧光光谱测试

3．3．6 探针7的选择性测试

3．3．7 H2S的浓度滴定

3．3．8 探针7的检测极限测定

3．3．9 细胞测试与活体生物成像

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 探针7的溶解度

3．4．2 探针7与H2S反应过程

3．4．3 探针7与H2S反应的荧光光谱

3．4．4 H2S的浓度滴定

3．4．5 探针7的选择性

3．4．6 活细胞内H2S荧光成像

3．4．8 癌细胞和小鼠肿瘤内源性H2S荧光成像

3．5 本章总结

第四章 发展蛋白Tyr和His标记方法

4．1 本章简介

4．2 发展蛋白Tyr标记方法

4．2．1 含酮基的Tyr标记试剂

4．2．2 含炔基的Tyr标记试剂

4．2．3 含四嗪基团的Tyr标记试剂

4．2．4 蛋白Tyr的交联试剂

4．3 发展蛋白His标记方法

4．4 本章总结

第五章 全文总结

参考文献

附录

致谢

研究成果和发表的学术论文

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