AM真菌调控黄花铁线莲生长和有效成分含量的机制研究

摘要

丛枝菌根真菌，即AM真菌（Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF），是一类广泛分布于土壤生态系统的有益微生物，可与90%的高等植物形成AM共生体，菌根。AM真菌能促进植物对营养元素和水分吸收，改善植物的营养状况，从而促进植物的生长发育，提高植物次生代谢产物的积累和抗逆性。　　黄花铁线莲（Clematis intricataBunge）为毛茛科铁线莲属草本植物。在中药、蒙药、藏药中作为一种重要的药用植物而被利用，其主要活性成分为黄酮类，有抗炎、镇痛和抗肿瘤活性，且毒性很小。　　本课题采用湿筛倾析法，研究内蒙古7个地区黄花铁线莲根际土壤AM真菌多样性；在盆栽条件下研究了不同氮（N）、磷（P）水平下接种摩西球囊霉（Glomus mosseae）对黄花铁线莲生长、生理生化特性和总黄酮积累以及利用qRT-PCR技术分析黄酮类生物合成途径关键酶基因响应不同N、P水平，探讨AM真菌对黄花铁线莲生长和有效成分含量积累的影响机制；利用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术克隆黄花铁线莲黄酮类生物合成途径的两个关键酶基因，苯丙氨酸解氨酶基因（CiPAL）和查尔酮合成酶基因（CiCHS），并对其进行生物信息学分析。本课题为规模化种植中蒙药材提供了菌根学和分子生物学依据。主要研究结果如下：　　1.从内蒙古7个地区的黄花铁线莲根际土壤中，共分离出3属29种AM真菌，其中球囊霉属Glomus27种，盾巨孢囊霉属Scutellospore1种，无梗囊霉属Acaulospora1种。结果表明，黄花铁线莲根际土壤中AM真菌多样性丰富。　　2.盆栽条件下，不同N水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生长有显著影响。不同N水平下，AM真菌均能侵染黄花铁线莲根系，并且能够有效促进黄花铁线莲的生长，提高产量；适N条件下，AM真菌通过影响过氧化物酶活性和渗透调节物质脯氨酸含量，促进黄花铁线莲生长；通过调控黄酮生物合成途径的相关酶基因的表达（其中CiCHS的表达量显著上调）而促进地上部分总黄酮的积累，能够有效改善黄花铁线莲的药材品质。高N则限制了黄花铁线莲生长，降低有效成分含量。因此，施N量为10%N～20%N时，接种AM真菌效果最好。　　3.盆栽条件下，不同P水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生长有显著影响。不同P水平下AM真菌均能侵染黄花铁线莲根系，并且能够有效促进黄花铁线莲生长，提高黄花铁线莲产量；适P水平下，接种AM真菌通过影响过氧化物酶活性和渗透调节物质脯氨酸含量，降低叶片丙二醛含量，使黄花铁线莲更好地生长；通过调控黄花铁线莲黄酮生物合成途径关键酶基因的表达（其中CiPAL和CiCHS的表达量显著上调），促进地上部总黄酮积累，改善了黄花铁线莲药用品质。综合考虑，施P量为5%P～20%P时，接种AM真菌效果最好。　　4.利用RACE技术，克隆得到CiPAL和CiCHS两个基因的cDNA全长序列。其中，CiPAL cDNA序列全长为2386bp，含有1个2118bp的完整ORF，编码705个氨基酸。在CiPAL的第187-202位，含有一个酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA），是典型的PAL家族成员；CiCHScDNA序列全长为1445bp，含有1个1191bp的完整ORF，编码396个氨基酸。CiCHS含有CHS-like和CHS酶家族两个保守功能域，是典型的CHS家族成员。　　5.本研究发现，在适量的N、P水平下，AM真菌能够有效促进黄花铁线莲生长，诱导黄酮类生物合成关键酶基因的表达，提高黄花铁线莲有效成分含量，改善其药用品质。

目录

声明

前言

第一章 内蒙古地区黄花铁线莲根际AM真菌多样性研究

1.1 样品采集

1.2 采样方法

1.3 试验项目与方法

1.4 数据处理

1.5 结果与分析

1.6 结论与讨论

第二章 不同氮磷水平下AM真菌调控黄花铁线莲生长和有效成分含量的机制研究

2.1试验材料

2.2试验设计

2.3 试验项目与方法

2.4 数据处理

2.5 结果与分析

2.6 结论与讨论

第三章 黄花铁线莲苯丙氨酸解氨酶基因（CiPAL）的克隆与分析

3.1 试验材料

3.2 试验项目与方法

3.3 结果与分析

3.4 结论与讨论

第四章 黄花铁线莲查尔酮合成酶基因（CiCHS）的克隆与分析

4.1 试验材料

4.2 试验项目与方法

4.3 结果与分析

4.4 结论与讨论

第五章 总结

参考文献

附图

文献综述:药用植物共生AM真菌的研究进展

缩略语表

攻读硕士学位期间发表文章情况

个人简历

致谢