发散式体外冲击波治疗家兔肩袖损伤的疗效评估与机制研究

摘要

研究背景:肩袖损伤是一类常见的关节运动损伤疾病，发病率高，并且肩袖术后愈合失败发生再撕裂率仍然较高。目前国际上对于促进肩袖愈合的多方面因素（生物学因素、手术方式等）相关研究很多，但仍未找到一种十分有效的方法。发散式体外冲击波治疗骨骼肌肉疾病在全世界范围内已得到了广泛应用，其相对于传统外科治疗有许多优势，具有非侵入性、操作简单，疗效显著、低风险、低消费等诸多优点，但目前关于冲击波治疗肩袖损伤的机制研究较少，用于其机制研究的相关动物模型也未有统一标准。　　研究目的:探索发散式体外冲击波对于家兔冈上肌损伤修复的作用及相关机制，为临床治疗肩袖肌腱病提供实验理论依据。　　研究方法:拟构建家兔肩袖损伤修复动物模型，筛选最优发散式体外冲击波治疗参数，评估冲击波治疗家兔肩袖损伤的效果并通过细胞实验探索相关内在机制。　　1.家兔肩袖损伤模型的建立:选取2～3月龄的新西兰家兔，常规麻醉俯卧于手术台，暴露并分离左前肢冈上肌，在其肱骨大结节处钝性离断冈上肌，用电钻在大结节合适位置制作骨隧道，穿线缝合固定冈上肌，逐层闭合切口，术中术后应用抗生素，标准条件下饲养动物，术后2周开始辅助人工手法康复。在造模后的各个时间节点（术后4周、6周、8周、12周）分别取材，生物学及生物力学多角度，分析模型的成功率及稳定性;　　2.冲击波优化参数设定:按照第一部分研究中选取的单隧道造模方法建立家兔单侧冈上肌（左肩）损伤修复模型，将60只家兔随机分为4组(N=15)，在术后2周分别给予不同能量的发散式体外冲击波治疗3次（间隔2天），然后分别在术后4周、8周、12周处死动物取材行墨汁灌注检测和病理切片染色分析（HE、胶原染色分析），通过最后比对结果，选择最优治疗参数;　　3.冲击波治疗家兔肩袖损伤疗效评定:选取8周龄健康家兔40只，并随机分成2组:造模组(N=20)、ESWT组(N=20)，健侧肢体作为自身空白对照(N=40)。常规建模、饲养，造模动物在术后2周开始行冲击波疗法（治疗方案同第2步）。从第4周开始分时间节点处死动物留取组织标本至12周结束。大体观察动物的生存状态及变化，包括食量、体重、步态、感染率、死亡率等;生物学测试，包括病理切片、组织特定蛋白含量鉴定(Western Blot)、墨汁灌注检测新生血管含量;影像学检测，包括X光片、B超、MRI平扫片;生物力学测试冈上肌终末抗拉力强度;综合评估冲击波治疗的效果及其对肩袖组织愈合的影响，初步探索肌腱修复过程中的内在信号通路及分子蛋白的变化，为体外细胞实验确定研究方向和靶点。　　4.冲击波促进肩袖愈合的机制研究:A.提取家兔肩损伤肩袖组织，体外培养并获取间充质干细胞和肌腱细胞，将不同能能量设置的冲击波直接作用于细胞培养体系，观察腱生基因及蛋白的表达及细胞活性、细胞增殖及迁移能力;B.敲除小鼠胚胎间充质干细胞C3H10的Smad3基因并与小鼠肌腱细胞TT-D6共培养，考察Smad3敲除后间充质干细胞的活性及对肌腱细胞的影响:针对C3H10细胞Smad3基因序列特征，分别设计合成三对荧光报告基因标记siRNA;脂质体包裹siRNA，以相同浓度，相同作用时间转染小鼠C3H10细胞;RT-PCR、WB筛选高效特异的siRNA;确定最佳转染浓度和时间。利用Transwell小室建立C3H10细胞和TT-D6肌腱细胞的共培养模型，验证敲低Smad3后对TT-D6肌腱细胞的影响。利用流式细胞检测、ELISA及RT-PCR的方法评估间充质干细胞纯度、细胞增殖、胶原合成、成肌腱标记物表达。　　研究结果:1.家兔冈上肌急性损伤修复模型是稳定可靠的动物模型，可重复性高、便于手术操作、性价比较高;2.与双隧道修复模型相比，建立肱骨大结节单隧道修复冈上肌的方法更有优势，在造模操作时间上耗时更少，且利于取材;3.冲击波治疗可以显著促进家兔肩袖损伤的愈合，改善组织纤维走行、瘢痕、组织形态、新生血管生成，促进肌腱修复及组织重塑，且本实验中家兔治疗的最佳冲击波能流密度参数为0.20mJ/mm2;4.发散式冲击波能够促进家兔肩袖愈合的过程，抑制Smad3的表达并上调Scleraxis的表达;5.Smad3表达下调的小鼠胚胎间充质干细胞C3H10与小鼠TT-D6肌腱细胞共培养后可显著增强肌腱细胞的迁移能力，促进肌腱细胞Scleraxis表达上调，并上调Ⅰ型胶原、Tenascin C的表达，已有的研究证实这种变化会抑制瘢痕形成，改善修复组织结构，从而提高愈合组织的终末抗拉力效果。　　研究结论:发散式体外冲击波对于家兔肩袖损伤修复模型有促进愈合的作用。家兔单隧道冈上肌损伤修复模型是用于冲击波机制研究可靠的动物模型。发散式体外冲击波可抑制损伤肩袖组织中Smad3的表达，并可能通过激活间充质干细胞作用于Scx基因进而上调Tenasin C、Ⅰ型胶原的表达、增强肌腱细胞的迁移活性和增殖能力，改善瘢痕组织重塑，最终达到促进家兔冈上肌损伤愈合的效果。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

二、肩袖损伤的动物模型

三、冲击波在骨科相关疾病的应用进展

参考文献

第一部分家兔冈上肌损伤rESW治疗模型的建立

一、背景

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第二部分发散式体外冲击波优化参数设定

一、背景

二、实验方案

三、研究结果

四、讨论

参考文献

第三部分发散式体外冲击波治疗肩袖损伤的疗效评定

一、背景

二、实验方案

三、研究结果

四、讨论

参考文献

第四部分发散式体外冲击波抑制Smad3激活间充质干细胞增强肌腱细胞迁移

一、背景

二、材料和方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

全文总结

一、本课题相关研究结果

二、本课题研究结论

综述促进肌腱愈合策略的研究进展

在读期间发表论文和参加科研情况说明

致谢