华夏TM白金PCR扩增试剂盒的法医学验证及评估

摘要

目的：通过验证华夏TM白金PCR扩增试剂盒的各项性能指标，调查其所包含的23个常染色体STR基因座在中国华东地区汉族人群、宁夏地区回族人群以及内蒙古地区蒙古族人群中的遗传多态性；并且通过对中国华东地区汉族与国内外其他人群等位基因频率分布的比较以及与目前国内外常见的7种STR商业化试剂盒的比较，综合评估该试剂盒在法医遗传学中的应用价值。　　方法：依据中国国家标准（CNS）“法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量认证标准”(GA/T815-2009)以及美国DNA分析方法科学工作组（Scientific Working Group on DNA Analysis Methods, SWGDAM）对试剂盒的确证指南，从灵敏度、稳定性、精确性及准确性、再现性及重复性、一致性、案件类型样本研究多个方面对华夏TM白金PCR扩增试剂盒进行验证。　　结果：⑴灵敏度：该试剂盒检测标准品007的灵敏度为0.125ng～2ng。⑵稳定性：在陈旧样本中，2007年和2015年采集的样本中，等位基因平均检出率分别为99.20％和81.41%。2009年、2010年和2014年采集的陈旧样本均获得完整且准确的分型结果。此外，无菌纱布上的血斑的等位基因平均检出率为99.4%，无菌滤纸片上的血斑的等位基因平均检出率为94.3%。⑶精确性及准确性：对该试剂盒中的Allele ladder在3500XL型遗传分析仪中的16道毛细管上同时电泳，结果显示3倍标准差值均在0.20之内，其等位基因片段的平均标准差未超过0.15。此外，对100份血液样本进行电泳分型，共检测到4053个等位基因。结果显示每份样本中每个等位基因与其相应的Allelic ladder等位基因片段长度的差值均在±0.50之内，最大差值为﹣0.41(Penta E)。⑷Stutter率计算：在Minus Stutter峰中，其滤过系数在4.09%（Penta D）到15.54%（D10S1043）之间。在 Plus Stutter峰中，其滤过系数在4.20%（Penta D）到19.46%（D10S1043）之间。⑸重复性：3种标准品（9947A、9948以及007）和2种类型的直扩样本（FTA卡上的血斑和唾液斑）在两个实验室不同的实验人员以及不同的实验仪器上得到完全一致和准确的STR分型结果。⑹案件类型样本研究：使用华夏TM白金PCR扩增试剂盒以及ForeseeTM FID23 DNA身份鉴定系统（提取）对模拟案件类型的样本进行 STR检测。结果显示两个试剂盒中相同STR基因座分型结果完全一致。⑺人群研究：在中国华东地区汉族、宁夏回族以及内蒙古地区蒙古族人群中共检测到的等位基因数分别为282（N=500）、196（N=50）和229个（N=100）。经χ2检验，23个常染色体STR基因座均符合Hardy-Weinbeing平衡。在三个群体中，其个体识别率（DP）值分别在0.796～0.986之间、0.782～0.968之间以及0.798～0.980之间。其多态信息含量（PIC）值分别在0.559～0.914之间、0.579～0.918之间以及0.566～0.912之间。由于各 STR基因座之间相互独立，经计算，三个群体的累计个体识别率(CDP)分别为1-4.1E-28、1-2.7E-25以及1-1.5E-26。此外，用Arlequin3.5软件对中国华东地区汉族与其他不同群体之间等位基因频率进行比较，结果显示华东地区汉族与蒙古族、藏族、彝族和鄂温克族四个人群相同的STR基因座的基因型频率分布的无差异，与其他国内外不同人群的某些基因座上均存在差异。⑻与7种常见的商业化STR检测试剂盒比较：华夏 TM白金PCR扩增试剂盒含有的基因座个数最多（25个）、其等位基因分型标准品（Ladder）中的等位基因数最多， Sinofiler和Identifier试剂盒所含有基因座个数最少（16个）。华夏 TM白金PCR扩增试剂盒(CDP:1-4.1E-28)的CDP值最高，国产试剂盒中， AGCU17+1试剂盒（CDP:1-4.9E-21）的CDP值较低，国外的Identifier（CDP:1-1.5E-17）、Sinofiler试剂盒（CDP:1-5.2E-19）的CDP值最低。　　结论：华夏TM白金PCR扩增试剂盒作为直接扩增的试剂盒，主要针对中国人群设计、其包含了FBI公布的最新的20个CODIS核心基因座以及中国公安部国家数据库常见的21个基因座。经验证，该试剂盒灵敏度高、重复性好、准确可靠、扩增流程简单快速，45分钟即可完成从免提取样本到扩增的全过程。此外，该试剂盒在中国汉族人群、回族人群以及蒙古族人群中具有良好的遗传多态性；与其他国内外常用的STR商业化检测试剂盒相比，该试剂盒可进一步提供更为丰富的遗传信息，具有更高的亲权鉴定和个体识别能力。

目录

声明

前言

1 材料

1.1样本

1.2主要试剂

1.3主要仪器与设备

2 实验方法

2.1 DNA提取

2.2 定量

2.3 PCR扩增

2.4电泳分型

2.5 华夏 TM白金PCR扩增试剂盒的SWGDAM的评估

2.6 人群研究

2.7 与常见的商业化STR检测试剂盒比较

2.8 统计分析

3 结果

3.1 灵敏度检测

3.2 稳定性检测

3.3 分型精确性和准确性检测

3.4 Stutter率的计算

3.5 重复性和再现性检测

3.6 案件类型样本及一致性检测

3.7 人群研究

3.8与常见的商业化STR检测试剂盒比较

4 讨论

4.1 华夏 TM白金PCR扩增试剂盒的SWGDAM的评估

4.2 人群研究

4.3与常见的商业化STR检测试剂盒比较

5 结论

参考文献

文献综述:短串联重复序列及STR商业化分型试剂盒的发展

缩 略 语 表

攻读学位期间发表文章情况

个 人 简 历

致谢