基因编辑的HepG2细胞中CYP3A4*1G对CYP3A表达及酶活性的影响

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摘要

英文缩略词表

前言

材料与方法

1材料

1．1菌株和细胞系

1．2载体

1．3主要试剂

1．4试剂盒

1．5主要仪器

1．6常用缓冲液和培养基的配制

2实验方法

2．1CRISPR/Cas9切割载体和reporter载体的构建

2．2转染HEK293T细胞筛选出高效率的sgRNA表达载体

2．3CYP3A4*1G GG和AA纯合子单克隆细胞株的建立

2．4单克隆细胞株的脱靶检验

2．5 CYP3A4*1G变异对HepG2细胞中CYP3A4 mRNA、蛋白表达水平和酶活性的影响

2．6 CYP3A4*1G变异对HepG2细胞中CYP3A5 mRNA和蛋白表达水平的影响

2．7利福平对CYP3A4*1G(GG／GA／AA)HepG2细胞CYP3A4、CYP3A5和PXR mRNA表达的诱导

2．9生物信息学分析CYP3A4*1G SNP位点转录因子

2．10统计学处理

3实验结果

3．1CRPSPR／Cas9切割载体构建成功

3．1．1px330-sgRNA载体的酶切鉴定结果

3．1．2pmcherry EGFP-reporter重组载体的酶切鉴定结果

3．2筛选出高效率的sgRNA表达载体

3．2．1转染HEK293T细胞观察绿色荧光蛋白的表达

3．2．2流式分析

3．3分选出目的细胞并得到单克隆细胞株

3．3．1分选细胞单克隆培养

3．3．2单克隆细胞测序验证

3．3．3单克隆细胞脱靶验证

3．4 CYP3A4*1G GG／GA／AA HepG2细胞中CYP3A4mRNA、蛋白及酶活性表达分析

3．5 CYP3A4*1G GG／GA／AA HepG2细胞中CYP3A5mRNA、蛋白及酶活性表达分析

3．6利福平对CYP3A4*1G GG／GA／AA HepG2细胞CYP3A4、CYP3A5和PXR mRNA表达的诱导

3．7CYP3A4*1G GG／AA RNA-seq检测及分析结果

3．7．1mRNA-seq检测结果的总体概述

3．7．2mRNA-seq检测结果分析方案

3．7．3样品的相关性

3．7．4 CYP3A4*1G GG／AA HepG2细胞CYP3A4、CYP3A5和PXR mRNA表达水平

3．7．5CYP3A4*1G GG／AA HepG2细胞中DMRT家族转录因子表达情况

3．8生物信息学中CYP3A4*IGSNP位点转录因子分析结果

3．8．1 DMRT3、DMRTA2、DMRTC2为CYP3A4*1G A等位基因特异结合或差异结合的转录因子

讨论

结论

参考文献

综述

个人简历

致谢