水稻内生放线菌OsiSh-2和OsiLf-2的抗病促生特性及作用机制分析

摘要

水稻(Oryza sativa)是全球最重要的粮食作物之一，实现其高产稳产是农业工作者关注的焦点。植物内生放线菌能产生丰富的次级代谢产物，在促进植物营养生长，增加生物量积累，并提高宿主抗逆能力等方面具有得天独厚的优势，在农业生产上具有良好的应用潜力，但迄今为止对内生放线菌与宿主互作的分子机理研究还相对较少。本研究以两株水稻内生放线菌StreptomyceshygroscopicusOsiSh-2和StreptomycesalbidoflavusOsiLf-2为研究对象，通过生理生化、分子生物学和蛋白质组学研究等手段，对其提高宿主水稻抗稻瘟病能力、促生长特性及其作用机理开展了系统研究，并取得如下研究成果：　　(1)确定了OsiSh-2和OsiLf-2在水稻体内对稻瘟病的防治效果和作用特点。大田试验中，分别喷施OsiSh-2和OsiLf-2的孢子悬浮液和无菌发酵滤液于水稻叶片，均可有效降低苗瘟的发病率，其中OsiSh-2的孢子悬浮液防治效果最好。进一步研究表明，两株菌的抗病效果差异可能与以下因素有关：OsiSh-2在水稻内的定殖能力强于OsiLf-2，其地上部重分离率可达100%，优于OsiLf-2(71.4%)；其次，OsiSh-2相比OsiLf-2能引起水稻体内更强烈的免疫反应，OsiSh-2处理后在水稻叶片上出现明显的类病斑现象，水稻体内H2O2积累、胼胝质沉积、防御酶POD活性和防御相关基因的表达水平均显著高于OsiLf-2处理组，且OsiSh-2诱导水稻免疫响应的时间也较OsiLf-2提前；最后，生物信息学研究表明，OsiSh-2和OsiLf-2产酶和次级代谢产物特性存在差异，OsiSh-2较OsiLf-2能合成更多次级代谢产物尤其是抑菌类物质，而OsiLf-2产植物激素IAA和GA的量明显高于OsiSh-2。　　(2)解析了OsiSh-2对水稻抗病促生的作用机制。OsiSh-2防治稻瘟病效果十分稳定，且存在剂量依赖性，最适施用浓度为108孢子·mL-1。大田环境下，OsiSh-2对水稻苗瘟的防治效率最高可达45.3%，特别是穗瘟时期可降低产量损失率达29.7%，优于农药三环唑的效果(18.7%)。作用机制分析表明，OsiSh-2诱导水稻产生的免疫反应使水稻处于“防御警备状态”，当稻瘟病菌侵染时可诱导H2O2和胼胝质快速大量积累，该过程较未预处理水稻至少提前4h。分泌蛋白质组鉴定到OsiSh-2分泌在水稻叶片表面的胞外蛋白中有很多属于碳水化合物水解的相关酶类，这些水解酶有可能诱导植物产生系统抗病性或直接抑制病原真菌生长。进一步采用串联质谱标签定量蛋白组学检测技术对发病前后OsiSh-2处理的水稻叶片中蛋白质样品进行定量检测和生物信息学分析，发现稻瘟病菌会抑制生长代谢通路中相关蛋白的表达，而OsiSh-2预处理的水稻响应稻瘟病菌入侵时，90%以上防御相关蛋白的表达水平较未接种OsiSh-2的水稻低，光合作用和氮代谢相关蛋白则相反。同时，OsiSh-2接种的水稻中61.49%的叶绿体定位蛋白在稻瘟病菌侵染时上调表达。利用透射电镜检测发现OsiSh-2定殖水稻后，叶肉细胞中叶绿体体积增大、淀粉粒增多，同时叶片中叶绿素含量、光合效率、氮代谢途径关键基因的表达水平也均高于未定殖OsiSh-2的水稻。可见OsiSh-2可以通过直接拮抗和间接调节水稻内源免疫响应双重作用协助宿主抵御稻瘟病，同时，通过刺激叶绿体发育等方式维持感病时水稻正常的生长发育。　　(3)阐明OsiLf-2对宿主的促生长作用特点和机制。OsiLf-2对不同品种水稻和拟南芥的生长发育均有明显促进作用，表现为宿主生物量积累增加、根系更加发达。其促生长机制一方面是能促进宿主对营养物质的吸收，尤其在低氮胁迫条件下，OsiLf-2可以通过提高水稻体内氮代谢相关酶的活性从而促进水稻对氮素的吸收和利用；另一方面，OsiLf-2自身合成IAA的水平是其影响宿主生长的重要决定因素，将OsiLf-2基因组中IAA合成途径的关键基因iaaM敲除后，突变体菌株IAA合成量减少，对水稻和拟南芥促生效果明显减弱。　　综上所述，本文以内生放线菌为研究对象，旨在揭示其与宿主在抗真菌病害和调节生长方面相互作用的新机制。同时，为微生物介导的水稻抗病促生育种研究提供理论基础，并为进一步开发新的生物农药和生物肥料提供有用资源。

目录

声明

英文缩略词

第1章 绪 论

1.1 水稻稻瘟病

1.1.1水稻稻瘟病概况

1.1.2稻瘟病菌的侵染与致病过程

1.1.3水稻与稻瘟病菌的相互作用模式

1.1.4稻瘟病的防治策略

1.2植物病害生物防治

1.3植物内生菌

1.3.1植物内生菌促进植物生长

1.3.2增强宿主植物抗非生物胁迫的能力

1.3.3提高宿主抗病害胁迫的能力

1.3.4维持内生菌-植物共生平衡的关键调控途径及机制

1.4植物内生放线菌在生物防治中的应用

1.5本论文的选题意义、目的及研究内容

第2章 两株水稻内生放线菌与宿主的共生互作

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1供试材料

2.2.2材料种植

2.2.3培养基

2.2.4菌株培养条件及菌液制备

2.2.5稻瘟病防效评定

2.2.6过氧化氢染色观察

2.2.7胼胝质沉积染色观察

2.2.8过氧化物酶活性测定（采用愈创木酚法）

2.2.9过氧化氢酶活性测定（采用紫外吸收法）

2.2.10荧光实时定量PCR

2.2.11水稻叶片表面扫描电镜分析

2.2.12 次级代谢产物合成基因簇预测分析

2.3结果与讨论

2.3.1两株内生放线菌具有不同的田间防治效果

2.3.2两株内生放线菌处理后水稻展现不同的叶和根表面形态

2.3.3两株内生放线菌处理可引起水稻体内不同程度的过氧化氢积累

2.3.4两株内生放线菌处理可促进水稻体内不同程度的胼胝质沉积

2.3.5两株内生放线菌处理可不同程度地提高水稻体内防御酶的活性

2.3.6两株内生放线菌激活水稻体内防御相关基因表达的程度和途径有所不同

2.3.7两株内生放线菌的产酶和次生代谢产物合成特点比较分析

2.4本章小结

第3章 内生放线菌S. hygroscopicus OsiSh-2调节宿主抗病与生长平衡的机制研究

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1供试材料

3.2.2材料种植

3.2.3培养基

3.2.4菌株培养条件及菌液制备

3.2.5稻瘟病防效评定

3.2.6过氧化氢染色观察

3.2.7胼胝质沉积染色观察

3.2.8荧光实时定量PCR

3.2.9水稻叶片表面扫描电镜分析

3.2.10水稻根系形态观察与扫描分析

3.3结果与讨论

3.3.1 OsiSh-2具有稳定的稻瘟病防治效果

3.3.2 OsiSh-2对稻瘟病的防效具有剂量依赖性

3.3.3 OsiSh-2促进未感病水稻的生长发育

3.3.4 OsiSh-2对稻瘟病菌致病过程的影响

3.3.5 OsiSh-2在激活水稻免疫增强抗病性中的作用

3.4本章小结

第4章 OsiSh-2-水稻-M. oryzae三者互作的蛋白质组学研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1供试材料

4.2.2材料种植

4.2.3培养基

4.2.4菌株培养条件及菌液制备

4.2.5分泌蛋白提取与鉴定

4.2.6水稻体内总蛋白提取与鉴定

4.2.7荧光实时定量PCR

4.2.8叶绿素含量测定

4.2.9光合作用测定

4.3结果与讨论

4.3.1 OsiSh-2在水稻叶表的分泌蛋白质组分析

4.3.2 TMT定量蛋白质组分析

4.3.3分子生物学、生理生化分析验证蛋白质组结果

4.3本章小结

第5章 内生放线菌S. albidoflavus OsiLf-2的促生机制研究

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1供试材料

5.2.2材料种植

5.2.3培养基与试剂

5.2.4菌株培养条件及菌液制备

5.2.5处理方法

5.2.6水稻根系形态观察与扫描分析

5.2.7叶绿素含量测定

5.2.8光合作用测定

5.2.9水稻体内总碳总氮含量测定

5.2.10水稻体内谷氨酰胺合成酶活性测定

5.2.11水稻体内硝酸还原酶活性测定

5.2.12菌体发酵液中生长素IAA和赤霉素GA含量定量检测

5.2.13菌株DNA提取

5.2.14目的基因片段克隆

5.2.15接合转移

5.2.16菌体发酵液中IAA含量的定性检测

5.3结果与讨论

5.3.1 OsiLf-2促进水稻幼苗生长

5.3.2 OsiLf-2提高水稻产量

5.3.3 OsiLf-2对不同品种水稻的促生作用

5.3.4 OsiLf-2促进水稻氮素吸收和利用

5.3.5 OsiLf-2对宿主体内IAA和GA的调节

5.4本章小结

结论和研究展望

1. 结论

2. 创新点

3. 研究展望

参考文献

附录A（攻读博士学位期间所发表的学术论文目录）

附录B

致谢