右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶协同催化制备低聚右旋糖酐与低聚糖的研究

摘要

右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶的协同催化是一个涉及生物多糖合成与降解的生化过程,本文采用重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶与真菌来源的右旋糖酐酶双酶联合法对低聚右旋糖酐与低聚糖的定向制备进行研究,通过对双酶体系关键影响因素的考察,分析双酶协同作用的规律,建立定向制备分子量可控的低聚右旋糖酐及功能性低聚糖的新型生产工艺,并采用波谱分析技术对低聚右旋糖酐的结构进行了初步探索。
　　1.以低聚右旋糖酐的制备为目的,首先运用动力学常数测定、双底物催化等实验挖掘出棘孢青霉右旋糖酐酶优先降解高分子右旋糖酐的特性,并将高分子的右旋糖酐作为该酶降解的底物,得到分子量为7kDa与5kDa的低聚右旋糖酐,总产率高达74.3％;然后,将右旋糖酐酶与右旋糖酐蔗糖酶进行不同方式的联合催化,结果表明:当右旋糖酐酶与右旋糖酐蔗糖酶同时加入低浓度的蔗糖溶液进行催化时,得到的系列右旋糖酐以分子量为5kDa的产品为主体;当右旋糖酐酶在右旋糖酐蔗糖酶催化的过程中介入时,得到的系列产品则会以分子量为20kDa和10kDa的右旋糖酐为主体;而将右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶协同作用于系列高浓度的蔗糖溶液,均能得到分子量为5kDa~10kDa的低聚右旋糖酐。运用双酶协同催化的方法,成功转化蔗糖得到三类分子量的低聚右旋糖酐(20kDa、10kDa、5~8kDa),产品分子量分布均匀,纯度良好。
　　2.以低聚糖的制备为目的,首先将右旋糖酐酶与右旋糖酐蔗糖酶构成双酶体系,对该体系的关键参数进行考察,以揭示双酶协同催化的规律,结果表明:在系列低浓度蔗糖(20~80 mg/mL)的双酶体系催化过程中,产物的分子量呈现先增后降的变化趋势,说明首先进行的是右旋糖酐蔗糖酶的合成作用,当合成的右旋糖酐到达一定分子量后右旋糖酐酶才开始发挥降解作用,右旋糖酐的合成与降解速率在反应过程中间会有一个平衡时间段,而后期则以右旋糖酐酶对右旋糖酐的降解为主;而在系列高浓度蔗糖(200~600 mg/mL)的双酶体系中,产物分子量呈下降趋势,并与底物浓度有一定的限制性关系。然后,对低聚糖的制备进行单酶降解与双酶合成的比较研究,结果发现:单酶降解右旋糖酐20得到的产物聚合度主要是 DP2-15,酶解速率与酶的用量成正比,并可以通过调控避免葡萄糖的生成,与酸解相比具有明显的优势;双酶催化蔗糖合成的低聚糖产物的聚合度 DP在2-10之间,富含DP2-DP5的功能性糖分,益生元特性更好。
　　3.首先运用红外光谱、1H–1H COSY及13C–1H HSQC检测了低聚右旋糖酐产品的特征官能团及分子内部 H-H、C-H关联。然后用1H NMR检测出双酶法制备的右旋糖酐20kDa含有96.03%的α-1,6-糖苷键和3.97%的α-1,3-糖苷键,右旋糖酐6kDa含有96.82%的α-1,6-糖苷键和3.18%的α-1,3-糖苷键。最后根据糖苷键的含量及分子量推测出这两种右旋糖酐的可能结构:右旋糖酐20kDa平均每101个α-1,6-糖苷键连接的主链即连接有4个α-1,3-糖苷键相连的侧链结构,而低分子的右旋糖酐6kDa约35个葡萄糖单元以α-1,6-糖苷键相连接,另外有1个葡萄糖单元以α-1,3-糖苷键连接作为侧链,具备高度的线性链式结构,可供后续衍生化应用。
　　本研究为双酶合成低聚右旋糖酐和低聚糖的工业化应用提供了数据支撑,为双酶协同催化机理的深入研究奠定了坚实的理论基础。

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第一章 绪论

1.1 右旋糖酐蔗糖酶

1.2 右旋糖酐酶

1.3 右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶联合催化的研究

1.4 右旋糖酐与低聚糖

1.5 本课题的研究意义

第二章 双酶协同催化制备低聚右旋糖酐的研究

2.1 引言

2.2 实验材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第三章 双酶协同催化制备低聚糖的研究

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第四章 右旋糖酐的质量与结构表征

4.1 引言

4.2 实验材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文