T细胞、MSC、FSH在再生障碍性贫血患者发病中的作用及人参皂苷Rbl治疗再生障碍性贫血的机制研究

摘要

第一部分 T细胞、MSC和FSH在再生障碍性贫血发病的作用研究　　目的:　　探讨T细胞、骨髓MSC和FSH在再生障碍性贫血发生中的作用。　　方法:　　收集90例再生障碍性贫血患者和37例对照人群外周血，通过流式细胞术检测T细胞亚群( CD3+CD4、CD3+CD8)、T细胞活化（CD25+/CD3+CD4+、CD69+/CD3+CD4+、HLA-DR/CD3+CD4+和CD25+/CD3+CD8+、CD69+/ CD3+CD8+、HLA-DR/CD3+CD8+)、调节性T细胞(CD4+CD25+FoxP3+)、B细胞(CD19)、NK细胞（CD16+56+/CD3-）、γδT细胞、补体系统CD55、CD59蛋白，用液态芯片检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-IO、IFN-γ、TNF-α等细胞因子；用透射比浊方法测定补体C3、C4;化学发光法测定男性再生障碍性贫血FSH浓度；同时采集再生障碍性贫血患者和健康对照组骨髓进行原代干细胞培养，传代，绘制生长曲线。　　结果:　　与对照组相比，再生障碍性贫血患者CD3+CD4+、CD4+CD25+FoxP3+T细胞比例、外周血红、粒细胞CD55、CD59表达、血清补体C3、C4水平显著降低，P＜0.05;CD3+CD8+、CD25+/CD3+CD4+、HLA-DR/CD3+CD8+、γδ等T细胞比例、血清IFN-γ、TNF-α、IL-4、FSH浓度显著升高，P＜0.05;急性再生障碍性贫血组IL-4、IL-6、IL-10浓度显著高于慢性再生障碍性贫血组，P＜0.05;与健康对照组相比，再生障碍性贫血患者MSC增殖能力减低。余均无显著性差异。　　结论:　　再生障碍性贫血患者存在T细胞的数量、亚群表型、分布及状态异常，其介导的细胞因子与疾病的发生和进程有关，MSC和FSH可能参与了再生障碍性贫血的发生。　　第二部分 FSH调节骨髓MSC免疫功能的研究　　目的:　　探讨FSH对骨髓MSC抑制淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的调节作用。　　方法:　　①取骨髓进行间充质干细胞原代培养，并进行流式表型、体外诱导分化鉴定。　　②用丝裂霉素预处理间充质干细胞，用活体荧光染料CFSE处理淋巴细胞，两者建立共培养体系，通过流式细胞仪检测荧光观察淋巴细胞增殖反应，通过液态芯片技术检测多种细胞因子观察淋巴细胞免疫功能的变化。　　③用RT-PCR方法检测骨髓间充质干细胞卵泡刺激素受体的表达；用不同生理剂量(0、3、10、30、1OOng/mL)的卵泡刺激素作用共培养体系48h，观察淋巴细胞增殖反应和细胞因子分泌的变化。　　结果:　　①骨髓间充质干细胞表达CD44、CD90、CD105，不表达CD34、CD45、CD14、CD11b、HLA-DR，在成脂诱导条件下，可分化为脂肪细胞。　　②间充质干细胞与淋巴细胞共培养与单独淋巴细胞培养相比，荧光显著增强；共培养体系中IL-6和IL-10分泌水平比淋巴细胞组显著升高，TNFα分泌水平出现显著下降（P＜0.05）。　　③与未加FSH组相比，30ng/mL、100ng/mL剂量FSH组作用共培养体系IL-6分泌显著下降，荧光强度显著下降(P＜0.05)。　　结论:　　骨髓间充质干细胞表达卵泡刺激素受体，具有促进淋巴细胞IL-6的分泌，抑制淋巴细胞增殖的功能，卵泡刺激素可以负性调节这种功能，呈剂量依赖性。　　第三部分人参皂苷Rb1对再生障碍性贫血小鼠造血及T细胞免疫功能调节的研究　　目的:　　用不同剂量中药人参皂苷Rb1作用再生障碍性贫血模型小鼠，观察其作用前后小鼠外周血WBC、Ret、CD4+/CD8+、IL-4、IFN-γ和骨髓CD34+等各项检测指标的变化，探讨人参皂苷Rb1治疗再生障碍性贫血的作用机理，为中医药治疗再生障碍性贫血提供理论依据。　　方法:　　48只清洁级雌性Balb/c小鼠中的40只用X射线照射，同时尾静脉注射同种异型小鼠DBA/2的胸腺细胞，建立免疫介导的再生障碍性贫血小鼠模型，随机分为六组，人参皂苷Rbl低(10mg/kg)、中(20mg/kg)、高(40mg/kg)剂量组、CSA阳性对照组、模型对照组、正常对照组，12天后处死小鼠，计数外周血WBC、Ret数量；流式细胞术检测外周血CD4+/CD8+比值、骨髓CD34+水平；ELISA检测血浆IL-4、IFN-γ水平。　　结果:　　与模型组相比：(1)人参皂苷Rb1低、中、高剂量组、CSA组小鼠外周血Ret显著升高(P＜0.05）；(2)人参皂苷Rb1高剂量组、CSA组小鼠骨髓CD34+比例显著升高(P＜0.05)；(3)人参皂苷Rb1中、高剂量组、CSA组小鼠外周血CD4+/CD8+显著升高P＜0.05)；(4)人参皂苷Rb1中、高剂量组、CSA组小鼠血浆IFN-γ水平显著下降(P＜0.05)。　　结论:　　人参皂苷Rb1能显著改善再生障碍性贫血小鼠骨髓造血功能，可能与调节T细胞功能有关。

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