体外侵袭实验分离高侵袭性和低侵袭性肾癌细胞

摘要

肾细胞癌，是泌尿系统常见肿瘤，浸润生长和远处转移是晚期肾癌的重要特征，近1/3的肾癌患者首诊时已属晚期，预后极差。肾透明细胞癌是肾细胞癌中最常见的病理类型，约占70％～80％[1]，因此筛选和鉴定肾透明细胞癌转移相关基因，寻找一与转移相关的生物学标志物，用于早期发现肾癌转移，对降低肾癌死亡率具有重要意义。而建立具有相同遗传背景的高、低转移性细胞株是寻找和筛选转移相关基因的基础和关键。肿瘤转移异质性理论认为，在肿瘤组织中存在着具有不同侵袭、转移能力的细胞亚群，而只有那些具有完成侵袭转移全过程能力如粘附能力、蛋白水解能力、细胞游走能力的瘤细胞才能最终形成转移灶。因此可依据某些侵袭、转移有关因素的表达与否筛选出具有不同侵袭转移能力的瘤细胞。 Matrigel胶是一种从EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜成分。主要由层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酞肝素糖蛋白(类肝素蛋白多糖)、纤维连接蛋白等组成。室温下Matrigel胶聚合成一种具有生物学活性的基质材料，在聚碳酸滤膜上形成一胶冻状物，封闭聚碳酸滤膜上的小孔，作用与哺乳动物细胞基底膜类似，只有那些具有蛋白水解能力的肿瘤细胞才能穿过聚碳酸滤膜上的小孔，无蛋白水解能力的非侵袭性细胞不能穿过。因此Matrigel胶可用于体外分离不同侵袭性肿瘤细胞。本研究拟构建侵袭小室，用于体外分离高侵袭性和低侵袭性肾癌细胞。分别从高侵袭性肾癌细胞和低侵袭性肾癌细胞中提取总RNA，并利用SMART。技术将RNA转化成cDNA，为进一步抑制性消减杂交打下基础。　　目的：筛选相同背景来源的高侵袭性和低侵袭性肾细胞癌细胞，对比二者差异。提取高、低侵袭性肾癌细胞的总RNA，并转化为cDNA，为研究肾细胞癌转移相关基因打下基础。 方法：对肾癌细胞株ACHN进行传代培养。在预实验确定铺胶浓度、消化回收时间的基础上，采用涂有Matrigel胶的Transwell对传代培养的肾癌细胞进行体外侵袭实验，分离回收高侵袭性和低侵袭性肾癌细胞。分别从高侵袭性肾癌细胞与低侵袭性肾癌细胞中提取总RNA,并利用SMART技术将RNA转化成cDNA。 结果：以浓度为1.17mg/ml、20μl/孔铺胶在。Transwell，固定细胞悬液密度(5×106/ml)，第48小时消化回收细胞较为理想。非侵袭性细胞呈散在生长，侵袭性细胞多呈聚集样生长，成功分离高侵袭性和低侵袭性肾癌细胞。从高侵袭性肾癌细胞与低侵袭性肾癌细胞提取的RNA经变性甲醛/琼脂糖凝胶电泳分析表明完整性和纯度良好，SMART。技术可以利用微量的RNA合成cDNA。 结论： Transwell可体外快速分离及回收、培养不同侵袭性的肾癌细胞。用肾癌细胞株ACHN进行体外侵袭实验代表性好，且传代稳定性好。成功提取了高、低侵袭性肾癌细胞的总RNA，并转化为cDNA，为研究肾细胞癌转移相关基因奠定了坚实的基础。

目录

论文说明：中英文缩略词表

声明

1.前言

第一部分细胞体外侵袭实验筛选高侵袭性和低侵袭性肾癌细胞

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.实验讨论

笫二部分高侵袭性和低侵袭性肾癌细胞总RNA的提取和分析

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.实验讨论

总结

参考文献

附录

致谢

综述 肿瘤转移的分子基础