甘油激酶GK与孤儿核受体NR4A1相互作用对小鼠肝脏糖脂代谢的调控

摘要

前期研究发现,糖脂代谢关键酶甘油激酶GK与核孤儿受体NR4A1存在蛋白质相互作用,并通过相互作用抑制NR4A1的转录活性以及糖脂代谢相关靶基因的激活,提示GK/NR4A1相互作用参与肝脏糖脂代谢调控。本课题应用小鼠活体转染和转基因动物,进一步研究GK-NR4A1相互作用对小鼠肝脏糖脂代谢的影响以及相关的调控机制。
　　我们首先应用NR4A1基因敲除鼠研究了NR4A1对糖脂代谢的影响。在对NR4A1基因敲除鼠进行饥饿或高脂高糖饲养后,进行葡萄糖耐受、丙酮酸耐受、胰岛素耐受实验,并检测血糖和血脂水平,应用ELISA方法测定血清胰岛素及胰高血糖素,进行肝组织切片糖原PAS染色。结果显示在饥饿18小时后,NR4A1敲除鼠与对照鼠相比,糖异生能力减弱,脂肪分解加快,体重下降快,糖原储备少(P<0.05),胰岛素下降,胰高血糖素上升。而在高脂高糖饲养16周后,NR4A1敲除鼠表现为体态肥胖,与对照组小鼠相比,体重增加、血糖增加、血脂增加、脂肪肝明显,且具有更明显的胰岛素抵抗倾向,NR4A1敲除鼠糖代谢基因代谢Eno3、G6pase的基因表达分别降低62％和56%;而脂肪代谢基因Srebp-1c、Fas等基因的表达则分别升高79%和40%。结果表明,在小鼠体内NR4A1缺失后,无论在饥饿状态还是经过高脂高糖饲养,肝脏糖脂代谢均发生紊乱,提示NR4A1参与肝脏代谢稳态调控。
　　随后,我们应用NR4A1基因敲除鼠和内源性NR4A1高表达的糖尿病模型(包括STZI型糖尿病鼠和db/dbII型糖尿病鼠,结合体内转染载体过表达技术,研究了GK-NR4A1相互作用对小鼠肝脏糖脂代谢基因表达、肝糖异生能力、肝糖原储备、血糖血脂及胰岛素水平的影响。结果显示,①在NR4A1过表达鼠、STZI型糖尿病鼠及db/dbII型糖尿病鼠中,NR4A1表达均升高,同时糖代谢相关基因如ENO3的表达分别上升32%、25%和25%;在此基础上过表达GK则下调ENO3基因的表达;②另一方面,在NR4A1野生鼠过表达GK下调糖代谢基因表达,在NR4A1敲除鼠中过表达GK则上调糖代谢基因表达,在敲除鼠中过表达无激酶活性GK突变体后,糖代谢基因表达则回落至对照组水平,提示在肝脏中GK通过激酶活性促进而通过与NR4A1相互作用抑制糖代谢基因的表达;③与糖代谢基因的变化相反,脂代谢基因在NR4A1高表达时表达下调,转染GK后则表达上调;在野生鼠中过表达GK上调脂代谢基因表达,在NR4A1敲除鼠中GK则下调脂代谢基因表达,而过表达无酶活性GK突变体使部分脂代谢基因表达回升至对照水平,但另外一些基因表达却没有明显回升,提示GK还可能通过其它方式参与代谢调节。
　　与基因表达类似,NR4A1野生鼠过表达GK还导致血糖下降、血脂上升,糖原分解加快,胰岛素的变化趋势与血糖变化相似;而在NR4A1敲除鼠中则无明显变化趋势,这一结果进一步表明NR4A1参与GK对肝脏糖脂代谢的调控。
　　上述研究揭示了在肝脏中GK不仅通过激酶活性直接参与糖脂代谢的调节,GK还通过与NR4A1相互作用间接参与糖脂代谢的调节,抑制NR4A1对糖脂代谢的调控,增强糖原分解、抑制糖异生过程,并反馈调节胰岛素和胰高血糖素的分泌,对维持机体正常的血糖血脂平衡起重要作用。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前言

主要仪器设备

溶液配制

第一部分 NR4A1对糖脂代谢的影响

1. 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 实验试剂及材料

1.3 实验方法

2. 结果

2.1 NR4A1基因敲除的繁育与基因型鉴定

2.2 实时定量PCR鉴定NR4A1的表达

2.3 NR4A1敲除鼠饥饿18h后代谢相关指标的变化

2.4 高脂饮食诱导的肥胖小鼠(high fat diet-induced obese mice，DIO-mice)

3. 讨论

4. 小结

第二部分 甘油激酶GK与核受体NR4A1相互作用调控肝脏糖脂代谢

1. 材料与方法

1.1 质粒

1.2 动物

1.3 常用试剂及材料

1.4 实验方法

2. 结果

2.1 pEGFP-N1在肝组织中的表达情况

2.2 小鼠尾静脉体内转染质粒不影响血糖和血脂的水平

2.3 C57BL/6体内过表达GK和NR4A1对糖脂代谢及相关基因表达的影响

2.4 STZ-I型糖尿病鼠体内过表达GK对糖脂代谢及相关基因表达的影响

2.5 db/db-II型糖尿病过表达GK对糖脂代谢及相关基因表达的影响

2.6 NR4A1基因敲除小鼠中过表达GK对糖脂代谢的影响

2.7 GK通过NR4A1抑制机体糖异生作用

2.8 GK通过与NR4A1相互作用抑制肝组织糖原合成

2.9 GK通过NR4A1抑制胰岛素表达水平

3. 讨论

4.小结

附录

英文缩写词对照表

参考文献

个人简历

致谢

综述