使用飞行质谱结合PCR技术及第二代测序技术检测乳腺癌与病毒相关性的研究

摘要

背景:　　乳腺癌是全球女性最常见的癌症类型,每年全世界估计有138万新发病例以及超过45万人死亡[1]。众所周知,乳腺癌是一种多因素的疾病,其中包括遗传,激素和环境因素等。近年有研究报道5％至10%的乳腺癌病例是由遗传基因突变引起的[2,3],然而大多数乳腺癌的病因仍然是未知的。某些病毒,细菌和寄生虫引起的感染已被确认为癌症的主要原因,据统计人类癌症的16%与这些微生物相关[4]。因此,接种疫苗将可能有效地预防这些癌症。根据国际癌症研究机构(InternationalAgencyforresearchonCancer,IARC)报告,爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-BarrVirus,EBV),乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV),丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus,HCV),卡波西肉瘤疱疹病毒(Kaposi’sSarcomaHerpesVirus,KSHV),人类免疫缺陷病毒类型1(HumanImmunodeficiencyVirusType1,HIV),人乳头状瘤病毒(HumanPapillomaVirus,HPV),人类T细胞淋巴性病毒类型1(HumanT-cellLymphotrophicVirusType-1,HTLV),幽门螺旋杆菌,华支睾吸虫,泰国肝吸虫,埃及血吸虫都是人类致癌微生物[5]。例如,感染慢性乙型或丙型肝炎病毒会导致肝细胞癌。慢性丙型肝炎病毒感染也可引起非霍奇金淋巴瘤,尤其是B-细胞淋巴瘤。这些发现为预防和治疗癌症提供了一个重要研究思路。　　自从Bittner发现小鼠乳腺肿瘤病毒(MouseMammaryTumorVirus,MMTV)可引起小鼠乳腺肿瘤以来,哪些病毒与乳腺癌有关,困扰了研究者几十年。许多研究表明,HPV,EBV,MMTV,猿猴病毒40(SV40),KSHV可能和乳腺癌有一定联系[7]。　　在乳腺癌的研究中,HPV感染的致病作用仍存在争议。有研究报道,大约有20%的人乳腺癌组织中HPV高危亚型呈阳性,尤其是HPV16,18和33[6]。相反,其它研究在乳腺癌组织中没有检测到任何HPV亚型[7]。究其原因,我们认为多可能与不同研究阶段的技术手段和水平相关。　　目的:　　本研究拟通过近年新兴和快速发展的飞行质谱(MALDI-TOF)结合多重PCR检测的质谱法(PCR-MS)及第二代基因测序技术(NGS)来检测乳腺癌样本中是否有病毒存在,从而发现乳腺癌可能的发病机制。　　方法和结果:　　PCR-MS在微生物检测和确认中是一个功能强大的工具,它可以同时检测多种感染。最近,课题组发明了一个新的高精确度的HPV基因分型检测方法(MS-HPV),即使用PCR-MS检测致癌的30种HPV亚型(E6和L1),这种方法可以避免质谱检测中常见的假阴性问题,使目标只有一个(E6或L1)。PCR-MS方法防止PCR遗留污染和多探针之间的交互污染[8]。　　在本实验中,首先使用PCR-MS方法对135例石蜡固定宫颈癌样本进行检测,同样也使用常规PCR+测序技术和商业HPV检测试剂盒对所有样本进行检测,然后与结果进行比对。结果发现新方法检测单一HPV感染比商业化试剂盒方法灵敏度高(97%;90.4%),在多重感染的检出中,新方法和商业化试剂盒方法的检出率分别为(55.6%;25.2%)。通过PCR复检,新方法的阳性率达87%(65/75)。　　使用MS-PCR方法在乳腺癌,乳腺良性肿瘤及健康志愿者样本中检测HPV,SV40,BKPyV,JCPyV,WUPyV,KIPyV,MCPyV,EBV和KSHV病毒的检出率。阳性结果都通过PCR和DNA测序证实。结果为:在乳腺癌中EBV,MCPyV以及HPV检出率分别为:74.0%,14%和2%;在乳腺良性病变中EBV和MCPyV检出率分别为:32%和2%。结果表明EBV和MCPyV在乳腺癌中的感染率较乳腺良性病变有明显统计学意义(EBV:74.0%vs.32.0%,p<0.0001;MCPyV:14.0%vs.2.0%,p=0.02)。然而在外周血中这两种病毒并没有统计学意义。实验结果证实EBV和MCPyV在乳腺癌中的检出率明显高于乳腺良性疾病,但这两种病毒是否为乳腺癌的高危诱因还需进一步研究。　　使用NGS联合高性能生物信息算法,检测8例乳腺癌样本中的病毒。研究发现大多数乳腺癌标本中都检出HPV16,部分标本有HBV感染。结果为:HPV在外周血,转移淋巴结,癌组织和癌旁组织中的检出率分别为:5/8,7/8,7/8,7/8。HBV在外周血,转移淋巴结,癌组织和癌旁组织中的检出率分别为:7/8,8/8,7/8,8/8。四个组织中HPV平均丰度的顺序从高到低依次为:外周血,癌旁组织,癌组织,转移淋巴结。四个组织中HBV平均丰度的顺序从高到低依次为:外周血,转移淋巴结,癌旁组织,肿瘤组织。此外,还对病毒感染进行定量分析,包括丰度,覆盖度和深度。但病毒是通过何种机制导致乳腺癌发生亦需要进一步深入研究。　　结论:　　乳腺癌中存在多种病毒感染,但它在乳腺癌发病机制中的具体作用还有待深入研究。

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实验一 通过飞行质谱结合PCR技术检测30种HPV的E6和L1基因

引言

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

实验二 通过飞行质谱结合PCR检测乳腺样本DNA病毒

引言

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

实验三 通过第二代测序技术检测发现乳腺癌中存在HPV 、HBV感染

引言

1实验材料

2试验方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢