玉米两种尿卟啉原脱羧酶的基因克隆及其催化底物的酶促合成

摘要

尿卟啉原脱羧酶（Uroporphyrinogen decarboxylase，UROD）是植物叶绿素、血红素和光敏色素的生色团分支合成关键酶，催化尿卟啉原Ⅲ脱羧产生粪卟啉原Ⅲ。高等植物含两种UROD。已发现UROD是氧化还原信号主要传递者硫氧还蛋白调节的靶蛋白，但是否调节两种UROD尚不清楚。研究硫氧还蛋白调节UROD的分子机制，阐明植物四吡咯分子合成与氧化还原信号之间的关系，具有重要意义。UROD的底物尿卟啉原Ⅲ易分解，其上游中间物5-氨基酮戊酸稳定性好。本文利用大肠杆菌重组表达系统，研究了玉米两种重组UROD的表达、纯化和活性。具体结果如下：
　　 1．根据已公布的玉米编码UROD的序列，使用Expasy server的ChloroP1.1软件分析编码玉米的两种UROD的导肽序列，预测得出Arg25为UROD1第一个氨基酸残基，Arg27为UROD2的第一个氨基酸残基，运用NEBcutter V2.0分析玉米两种UROD所编码的成熟蛋白的限制性内切酶位点，设计引物。利用Trizol法提取玉米B73自交系幼叶总RNA，RT-PCR扩增，产物约1kb，测序结果显示UROD1编码基因有5处突变，利用定点突变试剂盒，将突变位点恢复成野生型；UROD2编码基因有1处突变，利用BLAST软件序列比对表明突变编码的氨基酸残基和野生型相似。
　　 2．分别将两种UROD插入表达载体pQE80，诱导表达后SDS-PAGE未检测到特异条带。为提高UROD在大肠杆菌的可溶性表达水平，分别将UROD基因插入不同表达载体，表达的UROD的N端分别含有Trx、GST、MBP和SUMO担子蛋白，诱导表达后，仍然未检测到明显的特异条带。
　　 3．根据已公布的大肠杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶的hemB基因，编码胆色素原脱氨酶的hemC基因和编码尿卟啉原Ⅲ合酶的hemD基因，设计引物，利用CTAB法提取大肠杆菌DH5a基因组DNA，PCR扩增出特异片段，分别插入大肠杆菌表达载体，序列测定表明扩增的基因产物和公布序列一致。3个重组蛋白N端都含有组氨酸标签，诱导表达和亲和纯化后，SDS-PAGE显示蛋白纯度较高。
　　 4．利用纯化的三个重组酶，体外酶促合成并检测到了UROD的底物尿卟啉原，表明纯化的三个重组酶有活性。
　　 综上所述，本研究建立了玉米两种重组UROD快速纯化的技术体系，为进一步提高UROD蛋白产量及两种重组UROD的功能验证提供了理论及实验依据，这为进一步研究硫氧还蛋白对两种UROD调节的分子机制奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1 UROD的分布

2 酶学性质

3分子遗传

4 重组表达

5 空间结构

6 催化机理

7 调节机制

8 突变体

9 尿卟啉原化合物的生物合成途径

10 应用

引 言

本实验研究目的与意义

本实验研究内容

材料和方法

1 材料

1.1质粒和菌株

1.2试剂

1.3仪器设备

2方法

2.1玉米UROD基因的PCR扩增

2.2 UROD表达载体的构建

2.3 UROD蛋白的诱导表达与纯化

2.4 HemB、HemC和HemD基因的PCR扩增

2.5表达载体pQE80-HemB、pET28b-HemC和pET28b-HemD的构建

2.6 HemB、HemC和HemD外源基因的诱导表达与纯化

2.7 HemB、HemC和HemD的联合酶促反应

结果与分析

1 玉米两种UROD的生物信息学分析

2 基因扩增分析

3 蛋白表达

4 HEMB、HEMC和HEMD的克隆和表达质粒的构建

5 PQE80-HemB、pET28b-HemC、pET28b-HenD在大肠杆菌中的表达

6 尿卟啉原Ⅲ的体外联合酶促反应

讨论

1 UROD基因扩增的分析

2 玉米UROD基因表达载体及表达菌株的选择及分析

3 UROD的底物联合酶促合成

结论

参考文献

致谢

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