四种蛋传性病毒病多重PCR检测方法的建立

摘要

近年来，随着规模化养殖的迅速发展，由禽网状内皮增生症病毒(REV)、鸡传染性贫血病毒(CAV)、禽白血病病毒(ALV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽脑脊髓炎病毒（AEV）等多种蛋传性病毒引起的疫病在我国鸡群中普遍存在，且常出现多重感染，给养鸡业造成了巨大的经济损失。这些蛋传性病毒除引起亲代自身直接发病、慢性持续性感染、慢性肿瘤、免疫抑制等危害之外，更重要的是通过种蛋垂直传播子代形成新一轮感染。若是SPF种鸡感染蛋传性疾病，会通过鸡胚污染疫苗所造成的后果更是不堪设想。为此，本研究旨在建立一种针对鸡REV，CAV，ALV和ARV四种常见蛋传性病毒的快速、准确、灵敏的检测方法。
　　 试验首先对REV，CAV，ALV和ARV进行增殖，REV和ALV用CEF成纤维细胞增殖，ARV和CAV用SPF鸡胚增殖。分别对四种病毒的相关基因进行了同源性分析，筛选出了REV HA9901株LTR基因序列、CAV SD24株VP3基因序列、ALVHPRS103株的GP85蛋白基因序列、ARVS1113株S4基因序列作为PCR的扩增引物序列，分别建立了REV，CAV，ALV和ARV单项PCR检测方法。并对建立的方法进行了优化如退火温度、Mg2+浓度、引物浓度、酶浓度的优化；结果，这四种病毒引物扩增片段大小分别为409bp、580bp、1260bp、207bp，退火温度、引物浓度、Mg2+浓度、酶浓度分别为53℃、1.5μL、1.5μL、0.5μL。经序列分析、敏感性试验、特异性试验和可重复性试验表明，所建立的单项PCR方法可用于临床病料、细胞毒及鸡胚毒的检测。
　　 其次，试验在建立的单项PCR方法的基础上建立了REV-CAV-ALV-ARV四重PCR方法。并对建立的方法的条件进行了优化；试验结果确定最终的退火温度、引物浓度、Mg2+浓度、酶浓度。应用建立的方法对采自安徽省30份临床病料，分别采用单项PCR扩增和四重PCR方法检测，符合率可达93％，证明所建立的四重PCR方法稳定可靠。
　　 最后，应用该法对临床80份送检病料、5个种鸡场100枚种蛋进行检测，结果表明该四种蛋传性病毒病鸡群普遍存在，混合感染情况严重。某生物制品厂应用该方法对114批禽胚生产的活疫苗，有3批检测CAV阳性、2批检出ALV阳性，与该厂质检部成品活疫苗外源病毒鸡检法结果相吻合；对120批SPF种蛋和鸡胚进行检测，仅2批ALV检出阳性。经初步应用表明本研究建立鸡REV、CAV、ALV和ARV四种常见蛋传性病毒四重PCR方法，可用于临床诊断、流行病学调查、禽胚生产活疫苗及种蛋检测，具有重要的应用价值，达到预期目标。