猪常见四种病毒和四种细菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

摘要

猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病病毒在临床诊断过程中因具有比较相似的临床症状而较难确诊，同时金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门菌、大肠埃希菌四种致病菌时刻危胁着动物健康和公共卫生安全，而且其在病毒感染中常常继发感染，四种病毒和四种细菌中2~3种混合感染的病例较为常见，因此建立一种特异、灵敏、快速及量化的检测方法，用于临床诊断和检测疾病，同时为疾病的防控和净化提供帮助都是有必要的。本研究通过对以上四种病毒和四种细菌的NCBI中登录的相应基因保守序列设计特异性的引物与TaqMan探针，建立一种可以检测以上四种病毒和四种细菌的TaqMan多重荧光定量PCR方法，并初步应用于临床实践。本研究为猪群常见疾病的诊断和实验室研究提供一种良好的荧光定量 PCR 方法，为疾病的防控与净化提供了一定的技术基础。本研究取得如下结果： 1. 通过对猪瘟病毒的E2基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF7基因、猪圆环病毒2型的ORF1基因和猪伪狂犬病病毒的gE基因分别设计四对特异性引物和四条探针，建立能够同时检测四种病毒的多重TaqMan荧光定量PCR方法，并对其特异性、灵敏性及重复性进行了试验。结果显示，所建立方法的标准曲线具有良好的线性关系；不同病毒之间无交叉反应且仅有阳性模板有扩增信号，特异性强；TaqMan 多重实时荧光定量PCR方法检测的拷贝数最低分别为CSFV 3.28×102 copies/μL，PRRSV 3.76×102 copies/μL， PCV2 4.74×102 copies/μL，PRV 2.87×101 copies/μL，灵敏度最低比常规PCR高出10倍；重复试验变异系数系数在5%以下，重复性良好。使用建立方法检测了67份临床病料，结果比常规PCR多检出1份阳性和1份混合样。 2. 通过对金黄色葡萄球菌的nuc基因，链球菌ef-tu基因，沙门菌的ivnA基因以及大肠埃希菌的23S rRNA基因分别设计四对特异性引物和四条探针，建立能够同时检测四种细菌的多重 TaqMan 荧光定量 PCR 方法，并对其特异性、灵敏性及重复性进行试验。结果显示，所建立方法的标准曲线具有良好的线性关系；不同细菌之间无交叉反应且仅有阳性模板有扩增信号，特异性强；TaqMan多重实时荧光定量PCR方法检测的拷贝数最低分别为链球菌1.08×102 copies/μL，金黄色葡萄球菌9.59×101 copies/μL，沙门菌8.55×101 copies/μL，大肠埃希菌5.82×102 copies/μL，，灵敏度最低比常规PCR高10倍；重复试验变异系数系数在3%以下，重复性良好。使用所建立的方法检测人工感染病料，均能够特异性地检测出四种病原菌。

目录

第一章 猪常见四种病毒和四种细菌及荧光定量PCR方法的研究概况

1.1 猪常见四种病毒的研究概况

1.2 猪常见四种细菌的研究概况

1.3 病毒检测方法的研究概况

1.4 细菌检测方法的研究概况

1.5 实时荧光定量PCR检测技术的研究概况

1.6 本研究的目的和意义

第二章 猪常见四种病毒TaqMan多重荧光定量PCR方法的建立及初步应用

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 猪常见四种细菌TaqMan多重荧光定量PCR方法的建立及初步应用

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

致谢

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