BDNF基因转染骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及对耳蜗螺旋神经元保护作用初步研究

摘要

第一章人脑源性神经营养因子基因真核表达载体的构建及表达 目的：神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)在神经系统的生长发育、功能维持过程中发挥重大影响。近年来神经营养因子家族一些成员纷纷被克隆并应用于神经系统疾病的防治，取得了可喜进展。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作为神经营养因子家族成员，与外周听觉系统有着密切关系，不仅对耳蜗前庭神经元的发育成熟、增殖分化起重要作用，而且对损伤后神经元的修复、存活与功能重塑也影响深远。在此基础上，本研究对人脑源性神经营养因子(human BDNF，hBDNF)进行克隆，构建hBDNF真核表达载体pcDNA3.1(-)-BDNF，并用该载体转染人胚胎肾293细胞(human embryo kidney293 cells，HEK293)后检测BDNF的表达，为耳聋防治的进一步研究提供了基因来源。 方法：RT-PCR扩增人胚胎脑组织hBDNF基因片段，将基因片段与pcDNA3.1(-)质粒连接制成重组质粒。转化、筛选及扩增重组质粒，用EcoR I和BamH I酶切分析鉴定BDNF是否插入重组质粒。小量提取重组质粒后进行测序分析，将酶切检测和测序正确的pcDNA3.1(-)-BDNF重组质粒用QIAGEN-TIP100大量提取。重组质粒转染HEK293细胞，Western Blot法检测细胞中BDNF的表达。 结果：应用RT-PCR技术克隆出hBDNF基因。将hBDNF片段与pcDNA3.1(-)连接，成功构建重组质粒pcDNA3.1(-)-BDNF。酶切鉴定、DNA序列测定结果证实插入片段为hBDNF基因全长片段。Western Blot法检测到转染pcDN.A3.1(-)-BDNF的HEK293细胞中有BDNF的表达。 结论：成功构建了含hBDNF基因的真核表达载体：pcDNA3.1(-)-hBDNF，为开展基因治疗提供了重要的基因来源。 第二章脑源性神经营养因子基因电穿孔法转染骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞观察 目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)在转染人脑源性神经营养因子(BDNF)基因后在体外分化为神经元样细胞的功能。 方法：人BDNF基因克隆并构建其真核表达载体。取5只豚鼠的骨髓，分离培养贴壁细胞，观察其形态。CD34、CD44、CD45抗体流式细胞术鉴定所培养的细胞为BMSCs。将人BDNF基因电穿孔法转染BMSCs，G418筛选后用维甲酸(RA)诱导分化，神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体免疫细胞化学对分化细胞进行鉴定。 结果：分离培养的细胞具有典型的BMSCs形态和标志，人BDNF基因电穿孔法转染BMSCs的转染率约为25％，转染诱导后的细胞在外观上类似神经细胞，表达NSE、Nestin和GFAP。 结论：BDNF基因转染的BMSCs在体外能分化为神经元样细胞，电穿孔法能提高转染率，RA有促诱导作用。 第三章脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞耳蜗内移植初步观察 目的：探讨脑源性神经营养因子基因转染的骨髓间充质干细胞在受损耳蜗内的分化及保护功能。 方法：将转染了脑源性神经营养因子基因，并在体外诱导分化的骨髓间充质干细胞(BDNF-BMSCs)标记后，通过鼓阶注射植入阿米卡星致聋的豚鼠耳蜗内。并设耳蜗单纯注射人工外淋巴液、BMSCs、BDNF基因作为对照组。分别在注射后1W、2W、4W取耳蜗组织石蜡包埋切片。HE染色观察耳蜗组织病理学变化，计算SGNs密度；了解BMSCs的分布；NSE、Nestin和GFAP抗体免疫组织化学，观察BMSCs在蜗内的分化和SGNs的存活情况。 结果：阿米卡星致聋后豚鼠耳蜗结构受到损伤，SGNs数减少。诱导分化前后的BMSCs在耳蜗内均能成活并分布到一定的区域。 NSE、Nestin和GFAP免疫化学可见诱导分化后的BMSCs部分细胞阳性染色，而未诱导分化的BMSCs阳性细胞较少。用平均光密度(average optical density，AOD)分析免疫化学结果显示：耳蜗内BDNF-BMSCs在1W、2W时保持了较高的AOD值，和体外比较无明显区别，但在4W时显著下降(P<0.05)；在各时间点，BDNF-BMSCs组AOD值均显著高于BMSCs组(P<0.01)。 耳蜗内植入BMSCs、BDNF基因、BDNF-BMSCs均可拮抗阿米卡星的耳毒性损伤，其中BDNF-BMSCs保护作用最明显，表现为SGNs形态变化小，密度和NSE免疫化学AOD值高，与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。 结论：BDNF基因体外诱导的BMSCs耳蜗内移植后，其分化能力在一定时间内(约2W)保持不变，在4W时下降。耳蜗内移植BDNF-BMSCs比单纯移植BMSCs或BDNF基因具有更好的内耳保护作用。

目录

文摘

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论文说明：缩写词简表

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前言

第一章 人脑源性神经营养因子基因真核表达载体的构建及表达

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.2实验方法

1.2结果

1.2.1 RT-PCR获得BDNF基因CDS序列

1.2.2重组pcDNA 3.1(-)-BDNF质粒的筛选和鉴定

1.2.3 Western blot检测BDNF的表达

1.3讨论

1.4小结

第二章 脑源性神经营养因子基因电穿孔法转染骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞观察

2.1材料和方法

2.1.1材料

2.1.2实验方法

2.2结果

2.2.1 BMSCs形态特征和免疫原性

2.2.2 BDNF基因转染BMSCs

2.2.3 BDNF-BMSCs诱导分化

2.2.4免疫细胞化学

2.3讨论

2.3.1骨髓间充质干细胞的分化特性

2.3.2骨髓间充质干细胞的分化机制及影响因素

2.3.3骨髓间充质干细胞的免疫表型

2.3.4骨髓间充质干细胞的基因转染

2.3.5骨髓间充质干细胞诱导分化后的检测

2.3.6骨髓间充质干细胞的临床应用

2.3.7问题与展望

2.4小结

第三章 脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞耳蜗内移植初步观察

3.1材料和方法

3.1.1材料

3.1.2实验方法

3.2结果

3.2.1豚鼠ABR听阈检测

3.2.2骨髓间充质干细胞及其诱导分化后细胞在体外的标记

3.2.3耳蜗切片病理组织学观察

3.2.4耳蜗螺旋神经节细胞密度

3.2.5耳蜗标本荧光观察

3.2.6免疫化学结果

3.3讨论

3.3.1移植细胞的标记

3.3.2蜗内移植细胞的生存和分布

3.3.3蜗内移植细胞的分化

3.3.4受损耳蜗病理组织学改变

3.3.5细胞移植或基因治疗对耳蜗的保护作用

3.3.6骨髓间充质干细胞转基因治疗

3.3.7存在问题和展望

3.4小结

结论

参考文献

综述 骨髓间充质干细胞研究进展及在内耳移植的应用

致谢

在读期间研究成果