禽致病性大肠杆菌中Ⅲ型分泌系统2的分布及其组分EivC功能研究

摘要

细菌通过分泌系统将蛋白质转运到细菌胞外或直接注入宿主细胞内，与细菌的生存及致病性密切相关。Ⅲ型分泌系统（TypeⅢsecretion system，T3SS）存在于致病性大肠杆菌、沙门菌等细菌中，与毒力因子的分泌及致病力有关。研究人员发现EHECO157∶H7存在与沙门菌SPI-1类似的毒力岛，将其命名为E.coli TypeⅢsecretion system2(ETT2)。调查发现，不同致病性大肠杆菌中均含有ETT2毒力岛。尽管大部分ETT2毒力岛存在基因突变和缺失，其在黏附入侵、胞内生存、生物被膜形成等方面发挥重要作用。APEC（Avian pathogenic E.coli，APEC）属于肠道外致病性大肠杆菌（Extraintestinal PathogenicE.coli，ExPEC），可以引起禽大肠杆菌病，给养禽业造成巨大经济损失。研究表明，APEC与人ExPEC基因组结构相似，具有许多相同的毒力因子和相似的致病机制。因此，APEC是人ExPEC的毒力基因贮库，对人类健康造成潜在威胁。为了阐明APEC中ETT2的分布及其致病机制，本研究对APEC中ETT2进行流行病学调查，并分析ETT2ATPase EivC关键活性位点及其对APEC致病性的影响，为进一步研究ETT2在APEC中的致病机制提供参考。
　　1.ETT2在APEC中的亚型及流行病学调查
　　为了检测ETT2在APEC中的分布，本研究根据EHEC O157∶H7的ETT2毒力岛序列设计8对重叠PCR引物，检测ETT2在APEC临床分离株中的分布。然后，对ETT2目的条带进行测序，分析ETT2亚型。同时，通过PCR方法鉴定APEC的血清型、进化分群，并分析ETT2与血清型、进化分群之间的关联性。结果发现57.6％(141/245)APEC分离株含有ETT2毒力岛。测序结果显示APEC中ETT2分为完整型ETT2（命名为A亚型）和缺失突变型ETT2（命名为B、C、D、E亚型）。血清型分析表明ETT2主要存在于O1、O2和O78血清型APEC中。此外，O78血清型APEC仅含有缺失突变型ETT2，而完整型ETT2主要存在于O1和O2血清型APEC中。分析发现，T3SS相关基因簇(eip)仅存在于完整型ETT2阳性菌株中。大肠杆菌进化分群分析显示，66.7％(32/48)B1、64.8％(35/54)D、59.6％(31/52)A、44.9％(35/78)B2进化分群APEC含有ETT2。然而，ETT2毒力岛和其他毒力基因分布没有关联性。本研究表明，APEC中ETT2的亚型及分布均显著高于人的ExPEC，迸一步证明APEC对人类健康造成潜在威胁。
　　2.ETT2毒力岛组分EivC克隆表达及其ATPase活性分析
　　为了分析APEC ETT2毒力岛组分EivC的ATPase活性及其关键活性位点，本研究比对分析病原菌ATPase序列，分别设计克隆表达引物及点突变引物，然后构建重组表达质粒。经IPTG诱导表达后纯化相应蛋白，并检测其ATPase活性。结果显示，EivC蛋白包含F0F1ATPase的保守序列Walker Box A、Walker Box B及DCCD Box，因此EivC可能属于ATPase。酶活试验结果显示，His-EivC融合蛋白具有ATPase活性，磷酸盐释放速率为0.28±0.08mmol/min/mg。根据病原菌ATPase的关键位点，选择EivC蛋白第175位赖氨酸、第199位精氨酸、第201位精氨酸、第233位精氨酸进行点突变，然而点突变与野生型EivC的ATPase活性无显著差异。故本研究表明ETT2毒力岛组分EivC为ATPase，但是第175、199、201、233位氨基酸不影响其ATPase活性。
　　3.禽致病性大肠杆菌APCE94eivC基因缺失株、互补株的构建及特性分析
　　为了分析ETT2ATPase EivC对APEC表型和毒力的影响，本研究利用Red同源重组系统构建APCE94的eivC基因缺失株，并利用低拷贝质粒pSTV28构建eivC基因互补株。然后比较分析野生株、缺失株与互补株的生长特性、运动性、抗血清杀菌能力、黏附/侵袭能力、HD-11细胞内存活能力、动物致病力等差异。通过荧光定量方法检测APEC鞭毛、菌毛、毒力基因及HD-11细胞的细胞因子的表达水平;并通过透射电子显微镜观察细菌表面形态变化。结果显示，与野生株相比，eivC缺失株的生长特性无显著变化，但其运动性显著降低。电镜检测结果表明eivC缺失株表面的鞭毛减少，而菌毛增加，从而导致细菌运动性降低，荧光定量PCR结果显示鞭毛和毒力基因表达下调。另外，eivC缺失导致其抗血清杀菌能力、HD-11胞内存活能力显著下降。动物试验结果表明APEC94ΔeivC对雏鸭的致病力、体内存活和定殖能力显著降低。细胞炎症因子荧光定量分析发现缺失株APEC94ΔeivC感染HD-11细胞后IL-1β和IL-8显著上调，其可能与ETT2及其效应因子相关。研究结果表明，ETT2毒力岛ATPase EivC参与APEC的运动性和致病性。

目录

声明

致谢

摘要

图表目录

符号及英文缩略表

文献综述

引言

1 材料和方法

1．1 试验材料

1．1．1 菌株和质粒

1．1．2 主要试验试剂

1．1．3 主要仪器

1．1．4 培养基及试剂配制

1．2 ETT2在APEC中的亚型分析及流行病学调查

1．2．1 引物设计

1．2．2 细菌DNA的提取

1．2．3 PCR检测ETT2

1．2．4 血清型鉴定

1．2．5 大肠杆菌系统进化群分析

1．3 ETT2毒力岛组分EivC克隆表达及其ATPase活性分析

1．3．1 序列分析

1．3．2 克隆表达及点突变引物设计

1．3．3 eivC的克隆

1．3．4 PCR产物与表达载体的双酶切

1．3．5 酶切产物的连接

1．3．6 连接产物的热激转化

1．3．7 重组表达质粒的提取与鉴定

1．3．8 eivC点突变片段及重组表达载体构建

1．3．9 重组融合蛋白表达

1．3．10 融合蛋白的可溶性分析

1．3．11 融合蛋白的纯化

1．3．12 ATPase活性测定

1．4 禽致病性大肠杆菌APCE94 eivC基因缺失株、互补株的构建及特性分析

1．4．1 基因缺失、鉴定及互补引物设计

1．4．2 APCE94电转化感受态的制备

1．4．5 APCE94-pKD46电转化感受态制备

1．4．8 APCE94ΔeivC-Cm电转化感受态细胞制备

1．4．9 抗性基因的去除

1．4．11 互补株APCE94CΔeivC的构建

1．4．12 生长曲线和运动性测定

1．4．13 透射电子显微镜(TEM)

1．4．14 血清杀菌试验

1．4．15 细菌黏附和侵袭试验

1．4．16 胞内存活试验

1．4．17 荧光定量检测鞭毛、菌毛和毒力基因表达量

1．4．18 细胞因子检测

1．4．19 致病性测定

1．4．20 体内载菌量测定

2 结果与分析

2．1 ETT2在APEC中的亚型分析及流行病学调查

2．1．1 ETT2亚型和分布特征

2．1．2 ETT2在APEC不同血清型中的分布

2．1．3 大肠杆菌进化分群结果

2．1．4 与Ⅲ型分泌系统相关的eip基因簇

2．2 ETT2毒力岛组分EivC克隆表达及其ATPase活性分析

2．2．1 APCE94 ETT2序列分析

2．2．2 重组表达载体的构建与鉴定

2．2．3 融合蛋白的表达与纯化

2．2．4 ATPase酶活测定

2．3 禽致病性大肠杆菌APCE94 eivC基因缺失株、互补株的构建及特性分析

2．3．1 线性打靶片段扩增

2．3．2 eivC基因缺失株的构建及鉴定

2．3．3 eivC基因互补株的构建及鉴定

2．3．4 生长曲线及运动性

2．3．5 透射电子显微镜(TEM)

2．3．6 血清杀菌测定

2．3．7 细胞黏附及侵袭试验结果

2．3．8 胞内存活试验

2．3．9 荧光定量检测鞭毛、菌毛和毒力基因表达水平结果

2．3．10 细胞因子表达水平检测

2．3．11 致病性测定

2．3．12 体内载菌量测定

3 讨论

3．1 ETT2在APEC中的亚型分析及流行病学调查

3．2 ETT2毒力岛组分EivC克隆表达及其ATPase活性分析

3．3 禽致病性大肠杆菌APCE94 eivC基因缺失株、互补株的构建及特性分析

4 结论

参考文献

个人简介

硕士期间发表文章