基于红细胞膜包裹PLGA纳米粒自供氧药物递送系统的研究

摘要

研究目的:肿瘤的传统治疗方式比如化疗具有毒副作用大、耐药性等问题，近年来发展的新型治疗方式如声动力（Sonodynamic therapy，SDT）治疗具有诸多的优点，可以用于治疗深部肿瘤。然而在声动力治疗肿瘤过程中，常常因肿瘤部位缺氧限制声动力的治疗效果。针对上述问题，本课题构建了一个具有靶向作用的生物载体系统，将化学治疗与声动力治疗相结合，并将过氧化氢酶载入到载体系统内部，这样载体系统就可以将肿瘤内部的过氧化氢分解产生氧气，解决了声动力治疗中肿瘤部位缺氧的问题。此外，本课题对制备的载体系统的结构、形态、体外抗肿瘤活性、及体内药效学进行了研究。　　研究方法:(1)DOX/CAT@PLGA-RM/HA/HP载体系统的制备和表征实验中先制备PLGA纳米粒，将过氧化氢酶(Catalase，CAT)和化疗药阿霉素(Doxorubicin，DOX)同时载入PLGA纳米粒形成DOX/CAT@PLGA混合溶液。DOX/CAT@PLGA混合溶液中加入声敏剂（Hematoporphyrin，HP）和靶向剂(Hyaluronic acid，HA)通过挤压法在PLGA纳米粒外层包裹一层红细胞膜(Red blood cell membrane，RM)，制备了DOX/CAT@PLGA-RM/HA/HP药物递送系统。利用纳米粒度仪、透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）等表征载体系统。使用过氧化氢酶试剂盒检测载体系统中CAT的活性;高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）用于检测载体系统中DOX的包封率和释药率。　　(2)体外抗肿瘤活性及靶向性研究在体外细胞实验中，以人乳腺癌细胞(MCF-7)为细胞模型。分别研究载体系统的体外抗肿瘤活性、细胞摄取情况、声动力产生活性氧情况。使用MTT法检测载体系统对癌细胞的抑制率;荧光显微镜定性检测细胞对载体系统的摄取情况;通过流式细胞仪定量检测癌细胞对载体系统的摄取情况;使用荧光探针DCFH-DA检测超声条件下，载体系统在癌细胞内产生活性氧的情况。　　(3)体内药效学研究在体内药效学实验中，选择42只体重18±2g的昆明(KM)小鼠在右上肢皮下接种S180腹水瘤细胞，建立肿瘤模型。通过尾静脉注射给药，记录小鼠在治疗期间肿瘤变化情况，检测其治疗效果。根据小鼠体重变化及组织切片HE染色结果，检测载体系统的毒性。　　研究结果:纳米粒度仪和透射电镜分析结果显示，DOX/CAT@PLGA-RM/HA/HP呈球形，粒径约110.26±2.04nm，电位约-10.96±1.03mV。HPLC结果表明DOX成功包载进入载体系统，DOX的包封率为90％。过氧化氢酶试剂法检测得到过氧化氢酶的活性为1000(U/mL)。体外药物释放实验结果表明，该载体系统可以控释释放药物，在H2O2和US共同刺激下，实现药物的控释释放，48h时载体系统中DOX释放率达到86.5％。　　体外细胞实验结果表明，CAT@PLGA-RM/HA/HP生物相容性良好。DOX/CAT@PLGA-RM/HA/HP可将声动力和化学治疗相结合共同抑制癌细胞的生长。细胞摄取实验结果显示，HA修饰后DOX/CAT@PLGA-RM/HA/HP载体系统具有靶向性，细胞摄取效率达到96.1％。　　体内药效学实验结果表明，DOX/CAT@PLGA-RM/HA/HP可联合声动力和化学疗法，显著抑制肿瘤生长，相对肿瘤体积为0.90±0.40，显著低于相对肿瘤体积为8.00±0.60的空白组。　　研究结论:本研究构建的DOX/CAT@PLGA-RM/HA/HP载体系统，具有肿瘤靶向性，能够解决声动力治疗缺氧的问题，同时联合声动力和化学治疗，显著抑制肿瘤增长。

目录

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摘要

英文缩略词表

前言

第一章DOX／CAT@PLGA-RM／HA／HP系统的制备及性质考察

1仪器与试剂

1．1仪器

1．2试剂

2 PLGA纳米粒的制备与表征

2．1实验方法

2．2结果与讨论

3 DOX／CAT@PLGA-RM／HA／HP系统的制备与表征

3．1实验方法

3．2实验结果

4本章小结

第二章递送系统的体外抗肿瘤活性及靶向性研究

1仪器与试剂

1．1仪器

1．2试剂

1．3主要试剂的配制

2实验方法

2．1 细胞培养

2．2细胞毒性实验

2．3细胞摄取实验

2．4细胞内ROS的测定

3结果与讨论

3．2 DOX／CAT@PLGA-RM／HA／HP细胞抑制率

3．3细胞摄取实验

3．4细胞内ROS的测定

4本章小结

第三章诊疗系统的体内药效学研究

1仪器与试剂

1．1仪器

1．2试剂

1．3动物及细胞

2实验方法

2．1 细胞培养

2．2荷瘤小鼠模型的构建

2．3诊疗系统肿瘤抑制作用评价

2．4统计学分析

3结果与讨论

3．1诊疗系统抑瘤效果的评价

3．2组织病理学检测

4本章小结

全文总结

参考文献

致谢

个人简历