发育早期铅暴露致食蟹猴阿尔茨海默病样作用及其对表观遗传修饰的影响

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种与年龄高度相关、进行性发展的原发性神经退行性疾病。尽管AD的发病机制至今不明，但众多研究表明，β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein，Aβ)是各种原因诱发AD的共同通路，是AD发生发展的关键因素。因此，围绕Aβ展开的对AD发生发展进程中的各种影响因素及其调节机制的探讨是当今该领域研究的热点。　　 近年来，环境中低剂量铅(Lead，Pb)暴露对人群健康的影响已成为重要的公共卫生问题。发育期的中枢神经系统对铅的毒性尤为敏感，可导致儿童智力损害以及认知和注意力等神经功能障碍，而个体认知功能下降与AD的病理改变存在一定的相关性。基于成人疾病的胚胎起源假说，有学者提出AD存在早期起源的可能性，结合铅在神经系统发育中不可忽视的毒性效应，本研究认为铅可能参与了个体AD样变进程。　　 表观遗传(Epigenetics)是针对基因与环境相互作用所致基因表达变化的一个重要的适应机制。多数学者认为AD是一种由遗传因素和环境因素共同作用的复杂的异质性疾病，已有证据提示表观遗传修饰异常可能是迟发型AD发病的重要机制之一，因此本研究认为环境铅可能通过对表观遗传修饰的影响在AD的发生发展中发挥重要作用。　　 为验证上述假设，本研究运用食蟹猴队列研究并结合体外实验，探讨铅在AD样变进程中的作用及可能的表观遗传修饰效应，从而为进行AD的病因及发病机制研究提供科学依据。　　 目的：　　 1.基于发育早期铅暴露食蟹猴模型，探讨铅暴露、表观遗传修饰在AD样进程中可能致病机制。　　 2.通过构建铅暴露体外模型，探讨铅对SH-SY5Y细胞可能的AD样作用。评估铅暴露对SH-SY5Y细胞组蛋白乙酰化及甲基化修饰的影响。　　 材料与方法：　　 1.研究对象　　 1.1 动物模型：将刚出生的10只雌性食蟹猴随机分为两组进行队列研究。铅暴露组(23PbE)：从幼猴出生之日至400日龄每天饮用含醋酸铅的配方奶粉，剂量为1.5 mg·kg-1·d-1。对照组(23CT)：从幼猴出生之日至400日龄每天饮用无铅配方奶粉。两组动物断乳后常规无铅饮食饲养至23岁，分批次实施安乐死。另选择雌性食蟹猴8只，从出生之日至400日龄每天给予无铅配方奶粉饮食，自401日龄起断乳并开始常规无铅饮食饲养，于各取样节点(3～6岁或12岁)分批次对实验动物实施安乐死。分离双侧大脑皮层备用。　　 1.2 细胞株：选用人源神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞株作为研究对象。经RA分化后，分别给予终浓度为5μM～100μM的醋酸铅染毒。　　 2.方法　　 2.1 采用Western blot及免疫荧光分析技术检测各实验组AD相关蛋白、DNA甲基化修饰、组蛋白乙酰化及甲基化修饰相关蛋白的表达水平。通过微阵列分析技术检测神经生物相关基因的表达谱。　　 2.2 采用实时定量PCR分析AβPP、NEP基因mRNA的表达，采用ELISA方法检测醋酸铅暴露对Aβ1-40表达的影响，并对NEP活性进行荧光测定。　　 3.统计分析　　 使用SPSS12.0统计软件包进行实验数据的统计分析：两组数据比较采用两独立样本t检验，多样本均数之间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，以均数±标准误表示。两组样本间相关性比较采用Person相关分析。检验水准为α=0.05。　　 结果：　　 1.年龄及发育早期铅暴露对食蟹猴AD相关蛋白、DNMT1、DNMT3a及MeCP2表达的影响随着年龄的增长，食蟹猴皮层组织中AβPP蛋白水平逐渐升高。正常23岁龄组的表达高于3～6岁龄组及12岁龄组(P<0.01)。23PbE组AβPP蛋白表达水平高于23CT组(P<0.05)。随着年龄的增长，食蟹猴大脑皮层组织中NEP蛋白的表达呈现先增高后降低的趋势。正常12岁年龄组NEP蛋白的表达明显高于3～6岁龄组及23岁龄组(P<0.01)。此外，23PbE组NEP蛋白表达水平低于23CT组(P<0.01)。　　 随着年龄的增长，食蟹猴皮层组织中DNMT1蛋白的表达逐渐下降。正常23岁龄组低于3～6岁龄组及12岁龄组(P<0.01)。此外，23PbE组DNMT1蛋白表达水平也低于23CT组。各组DNMT3a及MeCP2与DNMT1蛋白表达趋势一致(P<0.05)。　　 2.发育早期铅暴露对食蟹猴神经生物相关基因表达的影响在筛检的588个与神经生物学相关基因中，发现16个基因的表达明显低于对照组，仅6个基因在铅暴露组的表达明显高于对照组。其中20个基因的启动子区域富含CpG。　　 3.年龄及发育早期铅暴露对食蟹猴组蛋白修饰水平的影响HDAC活性在正常23岁龄组食蟹猴皮层组织中的表达低于3～6岁龄组及12岁龄组(P<0.05)。与23CT组比较，23PbE组HDAC活性明显升高(P<0.01)。而特异性位点H3K9ac、H4K12ac蛋白水平在正常23岁龄组食蟹猴皮层组织中的表达均明显高于3～6岁龄组及12岁龄组(P<0.01)。23PbE组上述组蛋白位点乙酰化水平明显低于23CT组(P<0.01)。　　 正常23岁龄组G9a蛋白的表达明显高于3～6岁龄组及12岁龄组。23PbE组G9a蛋白表达水平高于23CT组(P<0.05)。各组特异性位点H3K9me2、H3K27me2蛋白表达水平与之一致。　　 4.醋酸铅对SH-SY5Y细胞AβPP、NEP及Aβ1-40表达的影响不同浓度醋酸铅暴露48 h后，SH-SY5Y细胞AβPP表达增加，并存在浓度依赖性。NEP蛋白在20μM～100μM醋酸铅暴露组(PbE)细胞中的表达低于对照组(P<0.01)。10μM～100μM PbE组细胞AβPP mRNA的表达均高于对照组(P<0.01)。5μM及10μM PbE组细胞NEP mRNA的表达低于对照组(P<0.01)。细胞经低浓度铅暴露(10μM)后，其NEP活性的下调发生于铅暴露48 h(P<0.01)。与对照组比较，5μM及10μM PbE组细胞NEP的活性水平均降低(P<0.01)。　　 随着醋酸铅浓度的升高，细胞培养液中Aβ1-40的表达逐渐升高(P<0.01)。细胞培养液中Aβ1-40含量与AβPP mRNA表达呈显著正相关(P<0.01)，而与NEP蛋白及活性水平呈显著负相关(P<0.05)。　　 5.醋酸铅对SH-SY5Y细胞组蛋白修饰的影响与对照组比较，50μM及100μM醋酸铅暴露可抑制SH-SY5Y细胞H3K9ac、H4K12ac位点组蛋白的表达(P<0.01)。经100μM铅暴露48 h，整体HDAC的活性水平明显升高(P<0.01)。铅暴露24 h时给予细胞10μM VPA干预，可显著下调SH-SY5Y细胞的HDAC活性及Aβ1-40的表达(P<0.01)。　　 与对照组比较，100μM PbE组H3K9me2位点甲基化表达明显增加，同时50μM及100μM PbE组H3K27me2位点甲基化表达明显增加(P<0.01)。与对照组比较，100μM PbE组G9a蛋白的表达明显增加(P<0.01)，细胞内G9a的定位表达结果与之一致。　　 结论：　　 1.年龄是食蟹猴AD相关蛋白表达及表观遗传修饰调控的重要影响因素。　　 2.发育早期铅暴露对食蟹猴AD相关蛋白表达的影响具有迟发效应，表观遗传修饰可能参与这一过程。　　 3.在铅暴露致SH-SY5Y细胞AD样作用的过程中，组蛋白乙酰化修饰参与Aβ表达的调控。