人骨髓间充质干细胞体外的分离培养及在血管紧张素Ⅱ诱导下向心肌样细胞分化的研究

摘要

目的： 心肌细胞丢失、瘢痕形成及心室重构是造成心脏功能恶化的主要因素，也是最终导致慢性充血性心力衰竭的主要病理基础。细胞移植治疗是治疗心脏疾病的一种新策略。骨髓间充质干细胞(BMSCs)目前被认为是细胞移植治疗最理想的种子细胞。研究BMSCs体外定向分化为心肌样细胞对细胞移植治疗心脏疾病具有重要的理论和临床意义。 本课题旨在通过血管紧张素II化学诱导等方法体外诱导BMSCs定向分化，检测BMSCs是否可分化为心肌样细胞，观察血管紧张素II对BMSCs生长增殖的影响，对BMSCs分化的可能机制作一探讨。本研究以人骨髓间充质干细胞为研究对象，实验分为两部分，第一、体外分离、纯化、传代人骨髓间充质干细胞(HBMMSc)。第二、血管紧张素II体外对HBMMSc向心肌样细胞的诱导分化的研究。 方法： 1.HBMMSc的分离，培养和传代及鉴定标本来源于正常人的骨髓。采用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，再利用贴壁筛选法纯化骨髓间充质干细胞后，进行原代和传代培养，并对其进行细胞生长和形态学的观察、表面抗原的鉴定。 2.HBMMScs在血管紧张素II的诱导下向心肌细胞的培养分化及心肌细胞的鉴定。收集第8代hBMMSCs，分4组为实验组3组和空白对照组。用0.1 μ mol/L Ang II诱导孵育hBMMSCs 24h。通过倒置显微镜形态学观察、半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法鉴定诱导细胞是否具备心肌样细胞的形态、结构特点及是否表达心肌特异性蛋白cTnI，GATA-4，Nkx2.5。 结果： 1.hBMMScs原代培养接种24h贴壁完成，2-3天细胞呈梭形，第9天形成多个克隆，第14-16天细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显方向性，细胞排列成漩涡状。传代细胞24h内完全贴壁，伸展成梭形，开始迅速增殖，7天即铺满培养瓶底，传代细胞保持原代细胞的形态特征。随代数增加，细胞得到纯化，梭形细胞达95％以上。连续传代至P8，细胞由梭形变为平坦、宽大，分裂相减少，细胞质疏松，可见空泡。传至P10，部分细胞变成圆形，折光增强，脱壁死亡。随着传代次数的增加，克隆形成率逐渐下降，10代后无明显克隆出现。流式细胞测定分离提纯后的hBMMScs表达CD29和CD44，不表达CD34和CD45。 2.Ang II诱导的细胞第8-10d即呈棒状，第18-21d细胞为长杆状，走向便趋一致。电泳检测证实.AngII诱导的细胞第2、3、4、5周已经表达cTnI，NkKX2.5，GATA-4，并且随时间推移，蛋白表达增强。空白对照组hBMMSCs无形态变化，不表达心肌特异蛋白。 结论： 1.利用淋巴细胞液进行密度梯度离心法和贴壁筛选法，可分离纯化hBMMSCs，细胞的均一性高，是一种简单，经济有效的分离提纯hBMMSCs方法。并且扩增细胞数量足够，遗传背景稳定，可满足组织工成要求。体外分离、培养hBMMSCs具有很好的成功率及成活率。 2 Ang II在体外可诱导第8代hBMMSCs分化为心肌样细胞。

目录

声明

摘要

前言

第一部分：人骨髓间充质干细胞的体外分离提纯及培养

材料与方法

第二部分：血管紧张素Ⅱ可诱导人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

材料与方法

方法

结果

附图

讨论

第一部分：人骨髓间充质干细胞的体外分离提纯及培养

第二部分AngⅡ诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

结论

综述 骨髓间充质干细胞及其在心血管疾病中的应用

致谢

个人简历