钛纳米管及其负载地塞米松的载药系统对骨髓间充质干细胞粘附、增殖及成骨分化的影响

摘要

研究背景:钛是一种骨科或牙科最常用的植入物生物材料。虽然其具有优良的机械和生物学性能，但长期观察表明，该类材料在体内的骨整合速度和能力相对较差[1]。如何改善钛的生物学性能，提高钛与周围组织的相容性，促进和加速骨整合已经成为众多学者研究的焦点。很多学者认为材料表面形态和结构是影响细胞附着和生长的一个最重要因素[2-4]。TiO2纳米管由于具有高比表面积和有序的一维内部结构，相对于光滑面纯钛而言，TiO2纳米管更有利于骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)的成骨向分化[5]。但关于不同管径TiO2纳米管对细胞粘附、增殖及分化能力的影响尚存争议[6-8]。MSCs是具有多向分化潜能的成体干细胞[9-10]，如何高效诱导其成骨向分化一直以来是骨组织工程研究的热点问题[11-17]。学者们普遍认为不同的培养基对MSCs成骨向分化的影响不同[13]，抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松的联合使用是体外诱导其成骨向分化的经典方法[16]。TiO2纳米管可以作为制备太阳能电池、制氢器及种植体的材料，还可以作为纳米储存器负载药物[18-21]。　　目的:1.研究不同管径钛纳米管表面结构对体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞粘附、增殖及成骨向分化的影响;2.在不同培养基中，对比研究SD大鼠骨髓间充质干细胞在TiO2纳米管表面的成骨向分化特点;3.构建负载地塞米松的钛纳米管载药系统，并研究其对骨髓间充质干细胞粘附、增殖及成骨向分化的影响。　　方法:分离并扩增MSCs，成骨、成脂向诱导分化及流式细胞鉴定;阳极氧化法分别制备管径30、70、100nm的TiO2纳米管。1.扫描电镜观察管径30、70、100nm的TiO2纳米管表面形貌、接触角测试材料表面亲疏水性;MTT法检测细胞在材料表面粘附及增殖情况，激光共聚焦显微镜观察细胞在材料表面形貌。评价细胞在纯钛、管径30、70、100nm的TiO2纳米管表面成骨向分化过程中碱性磷酸酶活性变化特征及矿化情况。Real-time PCR检测诱导14d后Runx2及OSX基因表达情况。2.使用4种培养体系:常规培养体系、抗坏血酸+β-甘油磷酸钠培养体系、抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+1α，25-双羟维生素D3培养体系、抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+地塞米松培养体系，分别在光滑面纯钛片，管径30、70、100 nm的TiO2纳米管表面培养MSCs，3、7、14d后检测碱性磷酸酶活性;21d后检测钙沉积量;14d后Real-timePCR检测成骨相关基因Runx2及OSX的表达。3.采用滴加法在管径30、70、100 nm的TiO2纳米管表面负载地塞米松;利用层层自组装技术(layer-by-layer self-assembly technique，LBL)制备明胶/壳聚糖多层膜复合结构;使用扫描电镜，接触角测试及X射线荧光显微镜（X-Ray Fluorescence Spectrometer，XRF）检测多层膜的构建。紫外分光光度计检测其药物释放性能。激光共聚焦显微镜及扫描电镜检测骨髓间充质干细胞在负载地塞米松的钛纳米管载药系统表面培养24h的生长形态。MTT法检测细胞在材料表面粘附及增殖情况。检测细胞在纯钛、管径30、70、100nm的TiO2纳米管表面培养3、7、14d后碱性磷酸酶活性变化特征及培养21d后的矿化情况。Real-time PCR检测培养7、14、21d的Runx2及OSX基因表达情况。　　结果:分离获得的MSCs具有成骨、成脂向分化的能力，CD29阳性细胞为99.65％，CD44阳性细胞为99.81％，CD45阳性细胞为1.42％;扫描电镜(SEM)观察各组材料表面管径均达到设计要求。1.管径为70nm的TiO2纳米管材料表面亲水性较好(P＜0.05); MTT结果示70nm组MSCs的粘附、增殖均较其他组明显增高(P＜0.05);30nm组在成骨诱导7d后，碱性磷酸酶活性均高于其他组(P＜0.05)。30nm组在成骨诱导21d后表面矿化高于其他组(P＜0.05)。30nm组在成骨诱导14d后Runx2及OSX基因表达高于其余组(P＜0.05)。2.同一种TiO2纳米管结构表面，抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+地塞米松组碱性磷酸酶活性(F=338.542，P=0.000)、钙沉积量(F=417.012，P=0.000)及成骨相关转录因子Runx2(F=14.419，P=0.000)和OSX(F=42.011，P=0.000)的表达均较其他组高，差异具有统计学意义;同一种培养体系下，管径30nm的TiO2纳米管结构表面碱性磷酸酶活性(F=53.170，P=0.000)、钙沉积量(F=264.268，P=0.000)及成骨相关转录因子Runx2(F=3.196，P=0.037)及OSX(F=5.895，P=0.003)的表达均较其他组高，差异具有统计学意义。培养体系与材料结构有交互作用(碱性磷酸酶活性(F=6.322，P=0.000)、钙沉积量(F=33.330，P=0.000)、OSX的表达量(F=2.825，P=0.015))，其中抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+地塞米松培养体系和管径30 nm的TiO2纳米管结构是最佳组合。3.制备的负载地塞米松的TiO2纳米管具备缓释功能;激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察到MSCs在负载地塞米松的TiO2纳米管表面的粘附及铺展状态较好;MTT结果示负载地塞米松的TiO2纳米管促进骨髓间充质干细胞的粘附及增殖;负载地塞米松的TiO2纳米管组在成骨诱导7d后，碱性磷酸酶活性均高于纯钛组(P＜0.05)。负载地塞米松的TiO2纳米管组在成骨诱导21d后表面矿化高于纯钛组(P＜0.05)。负载地塞米松的TiO2纳米管组在成骨诱导14d后Runx2及OSX基因表达高于纯钛组(P＜0.05)。　　结论:1.与光滑面纯钛相比，不同管径的TiO2纳米管对MSCs的作用各不相同，MSCs在管径70nm的TiO2纳米管表面增殖能力和粘附性较好，但在管径30nm的TiO2纳米管表面的成骨向分化能力较强;2.MSCs的成骨向分化与材料的表面结构和诱导药物的化学刺激相关。在相同的TiO2纳米管结构表面，MSCs在抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+地塞米松培养体系下成骨向分化能力较好;在相同培养体系下，管径30nm的TiO2纳米管结构更有利于MSCs的成骨向分化;抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+地塞米松培养体系和管径30nm的TiO2纳米管结构的组合条件最有利于MSCs的成骨向分化;3.制备的负载地塞米松的钛纳米管系统具备缓释功能，能促进MSCs的粘附、增殖及成骨向分化。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 不同管径钛纳米管对大鼠骨髓间充质干细胞粘附、增殖及成骨分化的影响的实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与结论

第二部分 钛纳米管及不同化学诱导条件对骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响的实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与结论

第三部分 负载地塞米松的钛纳米管对骨髓间充质干细胞粘附、增殖及成骨向分化的影响的实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与结论

全文总结

参考文献

文献综述 钛纳米管的制备方法及细胞学响应的研究进展

致谢

攻读硕士研究生期间发表论文及学术交流情况