抗VEGF抗体片段Feb在大肠杆菌的高效分泌表达

摘要

目前，抗体片段Fab在治疗人类多种疾病（如癌症、病毒感染、炎症等）方面起着重要作用。由于其缺少糖基化的Fc区，因此并不需要进行糖基化修饰。此结构特点使得Fab可在大肠杆菌中进行活性表达。Escherichia coli作为宿主菌株的突出优势在于低成本、生长快、易控制，在短时间内可以获得高产量，因此，已逐渐成为生产抗体的中坚力量。但是，在E.coli中生产抗体片段Fab的主要限制因素在于Fab的产量较低，原因主要是Fab易在胞质中错误折叠、聚集，形成无生物学活性的包涵体，且宿主菌中含有多种蛋白酶，对Fab有一定的降解作用等。因此，为提高抗体产量，可以从表达载体、宿主菌株、分子伴侣及折叠酶等几个方面着手，以期达到理想目标。
　　本课题从三方面对Fab的表达进行了优化:1）在实验室前期工作基础上，以E.coli DH11T7为宿主菌株，通过构建不同的Fab表达载体，最终提高Fab在E.coli中的产量;2）在1）工作的基础上，通过共表达多种分子伴侣，进一步提高Fab在E.coli中的产量;3）在E.coli周质蛋白酶缺陷菌株DH11-ptr-degp（以下简称86D）的基础上，对其基因组上spr（extragenic suppressor，抑制prc基因缺陷造成的菌体过早裂解）基因H145A位进行单个氨基酸突变，获得突变菌株86D-Mspr，同时共表达优势Fab表达载体及分子伴侣，最终通过发酵实验，提高Fab在E.coli中的产量。
　　对于Fab表达载体的构建，主要对信号肽进行优化。尤其是重链信号肽DsbA及STII，通过改变信号肽翻译起始区(translation initiation region，TIR)强度，将获得的13个重链片段分别与PelB-LC连接至pET-3b载体骨架，经ELISA分析获得了Fab最优表达载体的组合DsbA8+HC+PelB+LC(pET-DH8PL)，总产量约14mg/L左右。通过进一步构建单一分子伴侣表达载体及多个分子伴侣表达载体，能够在一定程度上改善Fab在E.coli中的分泌表达，尤其当以p15c-FkpA-SurA组合时，Fab产量可达到20mg/L左右，产量提高了30％。将宿主菌株由E.coli DH11T7替换为E.coli周质蛋白酶缺陷菌株86D时，抗体片段Fab的产量可提高20％左右。
　　E.coli属于原核表达系统，其发酵工艺相对简单，对表达宿主的大规模培养是为了获得大批量的抗体蛋白。本课题在实验室所构建的Red无痕敲除法的基础上，用类似的方法完成了对E.coli86D spr H145A单个氨基酸的突变，获得了基因组突变菌株86D-Mspr。第一步，将构建的供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB与辅助质粒pAAICDGBE共转入E.coli86D中，在L-阿拉伯糖的作用下，诱导表达Ⅰ-CreⅠ核酸内切酶和Red重组酶。Ⅰ-CreⅠ酶切割供体质粒上的左右同源臂及Cm抗性基因，并在Red重组酶的作用下，进行同源重组，最终在E.coli86D基因组上成功整合Cm抗性基因。第二步，将辅助质粒SN3K转化至第一步含Cm抗性基因的E.coli86D中，同样在L-阿拉伯糖作用下，诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶和Red重组酶。在Ⅰ-SceⅠ酶作用下，将基因组上的Is-Cm片段切除，同样在Red重组酶的作用下，左右同源臂与染色体发生同源重组，从而获得基因组突变菌株86D-Mspr。最终对其进行初步发酵工艺研究，在3L发酵罐中抗体片段Fab的产量可达到72mg/L左右。本工作为进一步提高抗体Fab产量打下了基础。

目录

声明

摘要

缩略词说明

前言

第一章 抗VEGF抗体Fab片段表达载体构建及信号肽优化

1．1 材料

1．1．1 菌株和质粒

1．1．2 引物

1．1．3 培养基及溶液

1．1．4 试剂

1．1．5 分子量标志物

1．1．6 工具酶

1．1．7 试剂盒

1．1．8 生物信息学软件

1．1．9 统计学分析

1．1．10 主要仪器设备

1．2 方法

1．2．1 琼脂糖凝胶DNA片段的回收

1．2．2 质粒的提取

1．2．3 化学感受态细胞的制备与化学转化法

1．2．4 构建信号肽突变体

1．2．5 构建Fab表达载体

1．2．6 不同表达菌株生长曲线的测定

1．2．8 Fab含量测定及分析

1．2．9 Protein L亲和层析柱纯化抗体片段Fab

1．2．10 抗体蛋白Fab浓度的测定

1．3 结果

1．3．1 Fab表达载体的构建

1．3．2 Fab表达载体的筛选

1．3．3 DsbA及STⅡ系列表达Fab载体的构建

1．3．4 DsbA及STⅡ系列表达Fab载体的筛选

1．3．5 抗VEGF-Fab的蛋白制备

1．4 讨论

第二章 分子伴侣表达载体的筛选

2．1 材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 引物

2．1．3 培养基及溶液

2．1．4 试剂

2．1．5 分子量标志物

2．1．6 工具酶

2．1．7 试剂盒

2．1．8 生物信息学软件

2．1．9 统计学分析

2．1．10 主要仪器设备

2．2．1 琼脂糖凝胶DNA片段的回收

2．2．2 质粒的提取

2．2．3 大肠杆菌基因组的提取

2．2．4 化学感受态细胞的制备与化学转化法

2．2．5 构建分子伴侣表达载体

2．2．6 不同分子伴侣在大肠杆菌DH11 T7中的筛选

2．3 结果

2．3．1 分子伴侣表达载体的构建

2．3．2 分子伴侣表达载体的筛选

2．4 讨论

第三章 蛋白酶缺陷菌株的构建及发酵工艺

3．1 材料

3．1．1 菌株和质粒

3．1．2 引物

3．1．3 培养基及溶液

3．1．4 试剂

3．1．5 分子量标志物

3．1．6 工具酶

3．1．7 试剂盒

3．1．8 生物信息学软件

3．1．9 统计学分析

3．1．10 主要仪器设备

3．2 方法

3．2．1 琼脂糖凝胶DNA片段的回收

3．2．2 质粒的提取

3．2．3 大肠杆菌基因组的提取

3．2．4 化学感受态细胞的制备与化学转化法

3．2．5 spr点突变菌株的构建

3．2．6 发酵培养基配方确定

3．2．7 起始培养基中葡萄糖浓度的筛选

3．2．8 蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺

3．3．1 构建spr基因突变的蛋白酶缺陷菌株

3．3．2 发酵培养基摇瓶筛选

3．3．3 起始培养基中初始葡萄糖浓度的确定

3．3．4 蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺

3．3．5 不同蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺

3．4 讨论

总结与展望

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果