小球藻抗氧化多肽的制备及其抗氧化和降糖活性研究

摘要

小球藻（Chlorella vulgaris）是一种球形或椭圆形单细胞淡水藻类，直径3～8微米，无性生殖，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广，极其容易获得，其作为一种高蛋白的海洋生物资源，高效益的实用价值还未被开发。近年来关于小球藻多肽防治糖尿病的动物实验研究和临床研究较少，其防治糖尿病的作用机制研究还有待进一步深入。小球藻多肽具有抗氧化活性，抗氧化活性对糖尿病的治疗和预防有一定相关性。基于此，本文以小球藻为原料，制备其抗氧化活性多肽，并分析其降糖活性，通过秀丽隐杆线虫体内的氧化酶活性、氧化簇水平、高糖环境下线虫寿命等方面对小球藻多肽的抗氧化活性和降糖效果进行探究，希望通过线虫实验建立理论基础，为后续的小鼠实验做铺垫。
　　为了避免工厂破壁造成的蛋白损失，本论文对小球藻破壁条件进行了探索，根据单因素实验和正交实验结果，得到了的4个最佳的小球藻破壁条件，氢氧化钠浓度、提取时间、提取温度和料液比，分别为3.9％、26.8 min、47.3℃和1:31，在此条件下，小球藻可溶性蛋白提取率为5.20%。该方法具有简单易行，不涉及大型仪器操作，提取时间适中，可溶性蛋白提取率较高的特点。
　　根据单因素实验的结果，我们选用复合风味蛋白酶作为小球藻活性多肽制备的蛋白酶，于50℃pH=6的环境中酶解5h，在该条件下获得的活性多肽DPPH清除率、超氧自由基清除率、羟自由基清除率、还原性、铁离子螯合率较高，活性多肽对 DPPH、超氧自由基及羟自由基的半抑制浓度 IC50分别为0.325mg/mL、0.325mg/mL和0.139 mg/mL。活性多肽能使线虫平均寿命延长39.20%，同时对处于高氧化性溶液中的线虫寿命有显著的提升，对氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性分别提升77.87%和1575.21%，降低活性氧簇13.66%。对α-葡萄糖苷酶活性、α-淀粉酶活性、蔗糖酶活性的半抑制浓度IC50分别为1157.81 mg/mL、1.70 mg/mL和3.38 mg/mL，延长处于高糖环境中的线虫平均寿命43.83%。多肽溶液经2种不同分子量的葡聚糖凝胶纯化，获得2种分子量相近的多肽，大小约为11.2 kDa。
　　实验证明，小球藻活性多肽具有较为理想的体外抗氧化能力，具有激发细胞内氧化物水解酶活性的效果，对过氧化氢酶活性提升尤为明显，其作用机理有待进一步的研究，活性多肽在协助细胞消除过剩自由基的基础上延长细胞寿命，保护细胞免受过氧化而凋亡。活性多肽表现出较高的多糖（双糖）水解酶抑制活性，可以减少生物体内的多糖（双糖）水解酶，将食物中多糖及双糖水解为葡萄糖，达到控制生物对葡萄糖的吸收效果。活性多肽对高糖环境下的线虫平均寿命具有较为明显的提升，高糖环境中线虫有较高的氧化水平，类似于糖尿病患者的胰岛β-细胞。因此，该活性多肽在理论上具有保护糖尿病患者胰岛β-细胞的功能。
　　本论文制备的活性多肽具有良好的体外和体内的抗氧化能力，同时表现出较高的降血糖效果，为新型抗氧化型降糖药物的研发提供了基础。

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目录

1 绪 论

1. 1 研究背景

1. 2 立题目的与意义

1. 3 本论文的研究目标与研究内容

2 小球藻蛋白制备及其纯化

2. 1 实验材料

2. 2 实验方法

2. 3 结果与讨论

2. 4 本章小结

3 小球藻活性多肽制备条件优化

3. 1 实验材料

3. 2 实验方法

3. 3 结果与讨论

3. 4 本章小结

4 小球藻活性多肽体内外抗氧化活性研究

4. 1 实验材料

4. 2 实验方法

4. 3 结果与讨论

4. 4 本章小结

5 小球藻活性多肽体内外降糖活性研究

5. 1 实验材料

5. 2 实验方法

5. 3 结果与讨论

5. 4 本章小结

6 主要结论与展望

6. 1 主要结论

6. 2 展望

参考文献

作者简历