促生长激素神经肽及其受体系统在大鼠糖尿病神经病变中的作用

摘要

糖尿病神经病变是糖尿病患者最常见的并发症之一，早期症状主要为感觉的障碍，临床表现为对称性的疼痛和/或感觉异常，以下肢远端为著，晚期可出现下肢的溃疡，糖尿病足，甚至导致截肢。不幸的是，由于对糖尿病神经病变的病理生理机制认知的缺乏，目前的治疗效果并不理想。在糖尿病中，病理学上出现周围神经纤维萎缩、脱髓鞘、纤维丢失和再生障碍，但其发生进展机制尚不完全清楚。
　　 促生长激素神经肽(galanin，Gal)是一种高度保守和广泛分布在中枢和外周神经系统的神经肽。它参与和调节体内许多重要的生理、病理过程，例如痛觉调节、神经保护、神经内分泌、认知、癫痫和肿瘤等，尤其是前两者，是近年研究的热点。Gal的所有功能由其G蛋白耦联的受体所介导。Gal受体1(galaninreceptor1，GalR1)和Gal受体2（galaninreceptor2，GalR2）广泛分布于中枢神经系统和周围神经节中。Gal受体都可以通过耦联Gi/o蛋白，抑制腺苷酸环化酶的活化。但不同的是GalR2还可以和Gq/11耦联，从而激活磷脂酶C(phospholipaseC，PLC)和蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)。
　　 在正常的情况下，Gal在背根神经节（dorsalrootganglion，DRG）的部分小神经元和脊髓灰质第Ⅱ层胶状质中的神经元中低表达，而在周围神经损伤后，其表达明显上调，这很可能是神经系统对神经损伤后的适应性反应。DRG和脊髓灰质后角(spinaldorsalhorn，SDH)中Gal表达的上调，在神经病理性疼痛状态下起着重要的调节作用。已有研究表明鞘内注射Gal可以减轻神经损伤引起的神经病理性疼痛。目前许多的研究表明，Gal的镇痛功能由GalR1介导，但其确切的抑制疼痛的信号转导机制尚不清楚。GalR2通过耦联Gq/11激活PLC和PKC，继而激活Akt和ERK信号转导通路，参与神经元营养保护和促进轴突再生的功能。
　　 已有研究表明Gal及其受体GalR1和GalR2在多种类型的神经病变中发挥着重要的作用，但其在糖尿病神经病变发病过程中的作用，目前尚不清楚。研究发现，糖尿病小鼠的坐骨神经损伤后，表达Gal的神经纤维再生延迟，并可能加重了神经病理性疼痛。进一步探讨Gal及其受体系统在糖尿病神经病变中的作用及其机制，对开展糖尿病神经病变的治疗新战略具有重要意义。
　　 本课题运用体内、外模型和多种实验方法，对Gal及其受体GalR1和GalR2在糖尿病神经病变中的痛觉调节与神经保护中的作用进行实验研究。
　　 第一部分，促生长激素神经肽对体外高糖培养的背根神经节神经元的影响作用
　　 高血糖被认为是引起糖尿病神经病变的主要原因。高血糖的糖尿病患者最终会发展成为某种形式的糖尿病神经病变。高浓度的葡萄糖能引起神经元损伤，这被认为是糖尿病神经病变的一个决定性因素。实验证明，高糖可引起体外培养的DRG神经元凋亡。Gal不仅参与体内的血糖和能量调节，而且具有神经元保护作用。但Gal对体外高糖培养的DRG神经元的作用及其受体的影响，尚不清楚。
　　 基于以上研究背景，本课题设计如下实验:
　　 胎龄为15d（embryonicday15，E15）胚胎大鼠的DRG神经元，体外分散培养48h后，随机分为5组:(1)高糖组:葡萄糖浓度为25mmol/L的neurobasalmedium内加入葡萄糖至终浓度为45mmol/L;(2)高糖+Gal组:葡萄糖浓度为25mmol/L的neurobasalmedium内加入葡萄糖至终浓度为45mmol/L，加入Gal至终浓度1μmol/L;(3)Gal组:葡萄糖浓度为25mmol/L的neurobasalmedium内加入Gal至终浓度1μmol/L;(4)甘露醇组:葡萄糖浓度为25mmol/L的neurobasalmedium加入甘露醇至终浓度20mmol/L，模拟高糖引起的高渗环境;(5)对照组:葡萄糖浓度为25mmol/L的neurobasalmedium，不施加任何干预因素。检测细胞内活性氧族(reactiveoxygenspecies，ROS)水平，检测细胞的活性，检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的激活，观察Hoechst33342染色细胞核形态的改变，Real-timeRT-PCR和Westernblot技术检测Gal及其受体GalR1和GalR2的表达。
　　 实验结果如下:
　　 (1)高糖培养可致DRG神经元胞内ROS水平升高，细胞活性下降，caspase-3激活，细胞凋亡，并引起Gal表达上升，GalR1表达下降。
　　 (2)外源性的Gal可以显著减轻高糖所致的神经元ROS水平升高和活性下降，减少caspase-3的激活和细胞的凋亡。外源性的Gal显著减轻高糖所致的Gal表达上升，但可进一步下调GalR1的表达。
　　 (3)各种实验条件对DRG神经元GalR2的表达无显著影响。
　　 以上结果表明，Gal及其受体系统参与了体外高糖分散培养的DRG神经元损伤过程。DRG神经元中Gal和GalR1在高糖或外源性Gal的培养条件下表达具有可塑性，而GalR2的表达则变化不明显;外源性Gal可以减少体外分散培养的DRG神经元高糖损伤所引起的凋亡。Gal对高糖损伤的DRG神经元具有明显的保护作用。这一实验结果为进一步探讨Gal及其受体在糖尿病神经病变中的作用提供了实验依据和新的思路。
　　 第二部分，促生长激素神经肽对糖尿病神经病变大鼠疼痛的作用及其机制
　　 糖尿病神经病变能引起痛觉过敏和异常性疼痛，但引起这种神经病理性疼痛的机制尚不清楚。DRG神经元是感觉传导通路的第一级神经元，参与了糖尿病神经病变。已经证实DRG是糖尿病感觉性神经病变的最常累及的组织之一。SDH是感觉尤其是痛觉传导和调节的重要中枢，有研究表明它也参与了糖尿病中神经病理性疼痛的调节。已有实验证明，Gal及其受体参与了神经病理性疼痛的调节。本课题研究了Gal及其受体在链唑霉素（streptozotocin，STZ）诱导糖尿病大鼠神经病理性疼痛中的作用。
　　 腹膜腔注射STZ(55mg/kg)诱导大鼠发生糖尿病，建立糖尿病神经性疼痛的模型。Real-timeRT-PCR和Westernblot技术检测DRG及SDH中Gal、GalR1和GalR2的表达。鞘内注射Gal、Gal拮抗剂M35、选择性GalR1激动剂M617、选择性GalR2激动剂AR-M1896，用vonFreyfilaments检测大鼠触觉痛觉阈值。
　　 实验结果如下:
　　 (1)STZ诱导糖尿病大鼠在第4w后可以产生稳定的触觉痛觉阈值下降，至少持续到第12w。
　　 (2)GalR1的表达在糖尿病大鼠DRG内下降，SDH内不变。
　　 (3)GalR2的表达在糖尿病大鼠DRG和SDH内下降。
　　 (4)外源性Gal可以减轻糖尿病大鼠痛觉过敏，提高触觉痛觉阈值。Gal拮抗剂M35可以阻断这种作用。
　　 (5)鞘内注射选择性GalR1激动剂M617可以提高糖尿病大鼠触觉痛觉阈值，而GalR2激动剂AR-M1896则未能发挥作用。
　　 以上结果表明，Gal及其受体系统参与了糖尿病神经病理性疼痛的调节。通过激活GalR1而不是GalR2可以减轻糖尿病引起的神经病理性疼痛，从而使GalR1可能成为糖尿病神经病理性疼痛的新的潜在治疗靶点。糖尿病神经病变中，Gal受体在DRG和或SDH中的表达下降，这种现象可能是糖尿病神经病变中的疼痛和神经损伤的关键环节。这些结果为进一步研究糖尿病神经病变，开发新的药物提供了理论基础和实验依据。
　　 第三部分，促生长激素神经肽对糖尿病神经病变大鼠坐骨神经损伤的保护作用
　　 糖尿病神经病变能引神经病理性疼痛、周围神经的损伤以及再生障碍，但引起这些神经病变的机制尚不清楚。本课题的第二部分证实了Gal及其受体参与糖尿病神经病理性疼痛的调节，本部分将进一步研究探讨Gal及其受体在STZ诱导糖尿病大鼠坐骨神经损伤后在神经病理性疼痛和神经再生中的作用。
　　 大鼠STZ诱导糖尿病12w后，与相同年龄正常大鼠随机分为6组:(1)糖尿病手术+Gal组:糖尿病大鼠坐骨神经夹伤后，每天鞘内注射外源性3μgGal。(2)糖尿病手术组:糖尿病大鼠坐骨神经夹伤。(3)糖尿病假手术组:糖尿病大鼠假手术，不损伤坐骨神经。(4)正常手术+Gal组:正常大鼠坐骨神经夹伤后，每天鞘内注射外源性3μgGal。(2)正常手术组:正常大鼠坐骨神经夹伤。(3)正常假手术组:正常大鼠假手术，不损伤坐骨神经。检测各组大鼠触觉痛觉阈值和热痛觉阈值，观察各组大鼠趾宽的恢复、神经传导速度(nerveconductionvelocity,NCV)和坐骨神经形态学的变化，检测各组大鼠DRG和SDH内Gal、GalR1和GalR2的表达。
　　 实验结果如下:
　　 (1)坐骨神经夹伤可加重糖尿病大鼠神经病理性疼痛，使触觉痛觉阈值和热痛觉阈值下降。
　　 (2)外源性Gal可显著减轻糖尿病和正常大鼠坐骨神经夹伤引起的神经病理性疼痛，提高大鼠的触觉痛觉阈值和热痛觉阈值。
　　 (3)外源性Gal可显著改善糖尿病和正常大鼠的趾宽、NCV，促进坐骨神经再生。
　　 (4)DRG和SDH内Gal、GalR1和GalR2的表达在各种不同的实验条件下具有可塑性。
　　 以上结果表明，Gal及其受体系统参与了糖尿病神经病变的病理发生过程。在DRG和SDH中，内源性Gal、GalR1和GalR2在糖尿病神经病变大鼠的坐骨神经夹伤后的表达变化与糖尿病神经病变的病理发生进程有一定的关系。外源性Gal可以明显改善糖尿病神经病变大鼠坐骨神经损伤后的痛觉过敏状态、NCV，加速趾宽恢复，促进坐骨神经再生。本课题为进一步研究Gal及其受体系统在糖尿病神经病变中的作用及其机制提供了新的理论基础和实验依据。

目录

声明

摘要

符号及缩略语

主要试剂及来源

主要仪器设备

第一部分 促生长激素神经肽对体外高糖培养的背根神经节神经元的影响作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 促生长激素神经肽对糖尿病神经病变大鼠疼痛的作用及其机制

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 促生长激素神经肽对糖尿病神经病变大鼠坐骨神经损伤的保护作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

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