脑出血血肿周围组织炎性因子表达和奥美沙坦对免疫反应影响的研究

摘要

论文Ⅰ亚低温对高血压性脑出血微创血肿清除术后血肿周围组织炎性因子表达的研究
　　研究背景:脑出血是常见病、多发病，死亡率和致残率极高，脑出血占脑血管病的10％到15％，其死亡率大于50％[1]。而脑出血后的治疗方法直接影响疗效。对高血压性脑出血患者早期使用微创血肿清除术治疗，可以使血肿对周围脑组织的压迫减轻，由于局部血肿压迫造成的缺血、水肿也可以得到缓解，血肿清除后，血肿分解产物造成的的血肿周围脑组织损伤也可以减轻，从而改善脑功能。而亚低温治疗具有确切的脑保护作用[2，3]。亚低温治疗的脑保护作用受到了极大重视，其可以通过抑制炎性反应、减轻脑水肿降低脑组织代谢等保护脑组织。近年来，人们对脑出血后的研究逐渐聚集在了血肿周围脑组织的脑功能保护上，普遍认为炎性反应参与了脑出血后血肿周围脑组织损伤的病理过程。在脑出血早期，血肿周围局部脑组织中就已经存在炎性反应;其中核转录因子-κB(NF-κB)和炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)起着重要作用，它们可以加重脑出血后血肿周围脑组织的损伤。
　　研究目的:采用亚低温联合微创血肿清除术治疗高血压性脑出血减轻血肿周围脑组织的炎性反应，使脑功能得以改善，并且此方法安全、有效、可行。
　　研究方法:收集临床76例急性自发性高血压性脑出血患者，随机分为微创血肿清除术组和亚低温治疗联合微创血肿清除术组，治疗前后均行NIHSS评分，微创血肿清除术组使用颅内血肿粉碎穿刺针进行微创颅内血肿清除术治疗，亚低温治疗联合微创血肿清除术组给予全身水循环式降温毯+冰帽脑局部亚低温治疗，所有患者于术中和术后1d、3d、7d取冲洗时所带出的血肿周围脑组织碎块，经甲醛固定保存，标本经石蜡包埋后作切片。血肿周围脑组织切片的NF-κB表达采用苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学法测定;TNF-α的检测:于术后1d、3d、7d清晨抽取空腹静脉血2-3ml分装于不同的试管中，采用ELISA法测定含量。研究结果:两组患者神经功能缺损程度NIHSS评分，在第3天和第7天亚低温治疗联合微创血肿清除术组神经功能缺损程度低于微创血肿清除术组，两组间差异有统计学意义(p＜0.05）。亚低温治疗联合微创血肿清除术组患者神经功能缺损程度NIHSS评分更好。脑出血后血液中TNF-α浓度、血肿周围脑组织NF-κB表达随病情变化而变化，血清中TNF-α的含量、血肿周围脑组织中NF-κB表达第3天时达到高峰。亚低温治疗联合微创血肿清除术组在各时间点TNF-α含量、NF-κB表达均低于单纯微创血肿清除术组(p＜0.05）。结论:亚低温治疗联合微创血肿清除术可以减轻血肿对周围脑组织的损伤，能更好的减轻炎症反应，减轻脑组织损害，改善脑功能。意义:亚低温治疗联合微创血肿清除术这种方法安全、有效、可行，能够在脑出血急性期减轻脑损伤，改善脑功能，让更多的脑出血患者获益。
　　论文Ⅱ奥美沙坦修饰的树突细胞对T淋巴细胞免疫功能影响的体外研究
　　研究背景:脑血管病是人类死亡和残疾的主要原因之一。高血压是脑血管病的主要病因，高血压也是动脉粥样硬化炎症反应最常见的危险因素。因此，积极降压、抗炎性反应治疗被用于防治心脑血管病。高血压动脉粥样硬化是一种慢性免疫炎症性疾病，它涉及到免疫系统、血管细胞和多个器官。免疫细胞启动和维持局部炎症。局部免疫炎症反应对动脉粥样硬化的发生和发展是必不可少的。树突细胞(DCs)和T细胞有助于局部免疫炎症应答和动脉中疾病进展。DCs是专职抗原递呈细胞(APCs)，递呈各种外源性和内源性抗原给T淋巴细胞，是先天性免疫和适应性免疫反应之间的一个重要链接。DCs可以将动脉粥样硬化炎性反应相关的抗原递呈给T淋巴细胞。DCs表面的共刺激分子CD80、CD86（这是众所周知的参与免疫突触形成和活化T细胞的分子）和MHC-Ⅱ与TLR(Toll-likereceptors,Toll样受体)和NLR(NOD-like receptor and NACHT-LRR receptor, NOD样受体和NACHT-亮氨酸重复序列受体)家族受体准确地结合，对DCs区分自我和外来抗原并递呈给T细胞的能力是至关重要的。DCs与T淋巴细胞结合后，DCs-T细胞相互作用，能够分泌趋化因子和细胞因子以维持局部炎症反应。
　　DCs与受体结合后，T辅助细胞前体细胞(Th0)被活化，Th0活化后可以分化为Th1和Th2细胞。Th1型细胞分泌的细胞因子主要包括干扰素-γ（IFN-γ），IFN-γ介导细胞免疫炎症应答，诱导并促进Th1细胞的分化，抑制Th2细胞免疫反应;细胞因子白介素-4(IL-4)和白介素-10(IL-10)主要由Th2型细胞分泌，其中IL-4可以诱导并促进Th2型细胞的分化，而IL-10可以抑制Th1型细胞分化。一般Th1的功能亢进以及Th1分泌的细胞因子被认为是促炎因素，而Th2及其所分泌的细胞因子被认为是抗炎因素。Th1细胞能有效地介导细胞免疫、细胞毒性T淋巴细胞、巨噬细胞活化以及迟发性超敏反应。Th2细胞可以介导体液免疫。CD4+T淋巴细胞是动脉粥样硬化炎症反应病变中的主要因素，它依据局部环境不同被分化为Th1和Th2细胞，在损伤处激活的Th1可能促进了粥样斑块的炎症反应，导致了动脉粥样斑块的不稳定性。而研究表明Th2细胞有助于动脉粥样损伤的稳定，主要是因为检测发现IL-10可以减少IFN-γ的分泌。高血压除影响患者血流动力学外，其血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平也升高、Th1淋巴细胞功能亢进并且Th1/Th2比例失衡。AngⅡ水平升高时IFN-γ水平也高，并且AngⅡ可以直接引起IFN-γ的分泌，使其水平增高。因此，高血压被认为也可以通过T淋巴细胞途径促进动脉粥样硬化炎症反应。而AngⅡ受体拮抗剂(ARBs)-奥美沙坦既可以降低血压，又可以抑制T淋巴细胞亢进所致的炎症反应。
　　肾素-血管紧张素系统（RAS）促进高血压和动脉粥样硬化的血管损伤，血管损伤是潜在的高血压病及其各脏器并发症的主要危险原因。局部RAS在炎症反应中也可能发挥作用。AngⅡ是RAS的下游活性肽，循环中AngⅡ通过与AngⅡ1型(AT1)和2型(AT2)受体结合后激活信号传导通路起作用。AngⅡ在靶组织可以通过与其AT1和AT2受体的结合调节血管功能。AT1受体广泛表达于参与动脉粥样硬化不同类型的细胞。AT1受体介导了大部分AngⅡ的病理生理效应，包括血管收缩、促进炎症和纤维化，通过变化多样的信号传导通路起调节介导作用，包括PLC/PKC/Ca2+浓度变化、PLA2、PLD、MAP激酶、酪氨酸激酶、原癌基因的表达、RhoA/Rho激酶和氧化应激。通过增加氮氧化物源性活性氧的产生和氧化还原反应转录因子激活，AngⅡ促进细胞粘附分子的表达、诱导合成炎症介质和生长因子。这些分子使血管通透性增加、白细胞聚集、钙化和血管纤维变性，导致血管损伤。而AT2可能会抵消很多AT1介导的效应。
　　AngⅡ唤起炎症反应，并且在由AT1受体介导的动脉粥样硬化炎性反应中起核心作用。ARBs类药物阻断了AngⅡ绝大多数不同生物效应。奥美沙坦主要与AT1受体结合，可以阻断AT1受体介导的AngⅡ生物作用。尽管所有ARBs类有共同的或者类似的化学结构，但是所有ARBs类的降压效果是不同的。临床使用的每一种ARBs具有独特的分子特异性效应对斑块的消退和稳定是非常重要的。奥美沙坦是一种重要的降压药物，因其独特的分子结构而可以减少动脉粥样硬化斑块的体积，具有抗动脉粥样硬化作用。特别是奥美沙坦还具有抗炎作用。同时，奥美沙坦可以抑制AngⅡ与AT1受体结合，使AngⅡ浓度升高，而利于与AT2结合。我们这次研究的重点就是ARBs类药物-奥美沙坦修饰的DCs对T细胞的影响，探讨其抑制T细胞的增殖及炎症反应的可能机制。
　　研究目的:探讨奥美沙坦修饰的大鼠DCs对T淋巴细胞免疫功能的影响及其相关机制。
　　研究方法:
　　1.耐受性树突细胞的制备及鉴定
　　无菌条件下取Lewis大鼠股骨和胫骨，充分冲洗骨髓腔并研磨骨髓后，制备单细胞悬液。破红细胞膜后，将细胞液置于培养瓶中，加入完全培养液，于37℃、5％CO2条件下培养3天。换液后留取贴壁细胞，加入完全培养液继续培养。第7天再换液，换液后18小时向培养瓶中加入提前配制的奥美沙坦(使其终浓度为10μM)，把相同体积预先配制的DMSO溶液加入对照组培养瓶中。继续培养，第10天，收集悬浮的细胞，分别记为奥美沙坦修饰的DCs和未经奥美沙坦修饰的DCs。
　　2.DCs表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ表面分子的检测
　　取每流式测定管中DCs细胞数1×106个/ml，加入1 ml PBS液洗涤细胞，离心，2000rpm，5 min，弃上清，加入1.5 ml0.5％ BSA洗涤后，加入1μl抗体，4℃冰箱中孵育30 min，用1.5 ml0.5％ BSA洗两次，加500μl PBS，混匀，重悬细胞，用滤网过滤后，流式细胞仪进行检测。
　　3.DCs中IL-10和TGF-β细胞因子的检测
　　每个流式测定管中加入DCs细胞数1×106个/ml，加入2 ml PBS洗涤细胞，2000rpm，离心5 min，离心。加入2％多聚甲醛，放置在4℃，孵育20 min。离心，2000 rpm，5 min。加入2 ml0.5％ BSA洗涤细胞，再离心，弹起细胞。加入1 ml皂甙破细胞膜，室温放置20 min。用1 ml0.5％ BSA洗涤细胞2遍，充分震荡，离心后弃上清液，将细胞充分弹起。加入PE标记小鼠抗大鼠IL-10和兔抗大鼠TGF-β抗体，混匀，在室温下，避光孵育30 min。再加入2 ml0.5％ BSA洗涤细胞1次，离心后弃上清液，再将沉淀充分弹起。每管中加入500μl PBS重悬细胞。用滤网过滤，立即上机，流式细胞仪检测DCs胞内细胞因子IL-10和TGF-β浓度。
　　4.免疫大鼠模型的建立
　　此次实验中，使用雌性、健康的Lewis大鼠，先将OVA溶于生理盐水、不完全弗氏佐剂和H37Ra株热灭活结核杆菌中，配制成溶胶，然后分别取200μl，皮下注射于每只大鼠的双后足垫，免疫Lewis大鼠。我们把注射当天定做是0天，第8天同等剂量于大鼠背部再次注射一次，剂量与第1次相同，采用双盲观察，每日称重并观察大鼠的表现，直至第二次免疫后第5天。建立了免疫大鼠模型。
　　5.取淋巴结制备单细胞悬液
　　麻醉OVA免疫后大鼠，在无菌条件下取大鼠双侧腹股沟淋巴结，用无菌研磨棒进行研磨，直至组织变白，完全吸取研磨液放入离心管中，制备成淋巴结单细胞悬液。离心，弃上清液后，混匀细胞。用计数板计数，调整细胞浓度为2×107个/ml，备用。
　　6.CD4+T细胞的分选
　　尼龙棉柱滤过法分选CD4+T细胞:先称取150 mg尼龙棉，填入注射器内(10毫升)，使其高度为6 cm，高压灭菌后备用。用含FBS1640培养液洗涤尼龙棉柱各2次，37℃放置1小时。过滤细胞前，先将棉柱内的液体放出，取细胞数为2×107个/ml的淋巴结单细胞混悬液，缓慢地滴入棉柱内，速度为20滴/min，平放尼龙棉柱，用滴管伸入棉柱内的界面内加入完全培养液封闭，将尼龙棉柱孵育1h。用常温的完全培养液洗涤尼龙棉柱3次，控制流速，收集最初的流出液，离心，弃上清液后并混匀细胞，细胞计数并调整细胞数为1×106个/ml，备用，此即为分离纯化的CD4+T淋巴细胞。
　　7.T淋巴细胞CFSE增殖实验检测
　　取CD4+T淋巴细胞10×106个到离心管内;离心后重悬，加入CFSE，37℃孵育，冰上放置后离心，用1640液洗涤2遍，用细胞完全培养液重悬后，种于24孔板中，把未经奥美沙坦修饰的DCs和奥美沙坦修饰的DCs分别加入孔中，同时加入OVA（终浓度为10μM），与T淋巴细胞共培养72 h，流式细胞仪检测T淋巴细胞增殖。
　　8.T细胞培养上清液中IFN-γ细胞因子ELISA检测
　　经OVA刺激的淋巴结T淋巴细胞与DCs联合培养，共60 h，然后取细胞培养上清液留存。依照IFN-γ试剂盒说明书，进行ELISA操作，检测细胞培养上清液中细胞因子IFN-γ的表达水平。
　　9.统计学分析
　　实验结果资料的统计学分析，采用SPSS17.0软件进行，两组间比较，使用独立样本t检验,p＜0.05被认为有差异，有统计学意义，结果采用均数土标准差(standard deviation，SD)表示。
　　实验结果:
　　1.奥美沙坦没有诱导产生耐受性DCs
　　采用流式细胞仪检测，发现两组DCs间表面分子表达有趋势，共刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ在奥美沙坦修饰的DCs组比未经奥美沙坦修饰的DCs组低表达，但统计学没有差异(p＞0.05)。
　　2.奥美沙坦使DCs胞内细胞因子IL-10的水平上调
　　通过流式检测发现，奥美沙坦修饰DCs组较未经奥美沙坦修饰DCs组明显高表达IL-10(p=0.07);但是两组间TGF-β的水平统计数据虽有趋势却没有达到统计学差异。
　　3.T淋巴细胞增殖被奥美沙坦修饰的DCs抑制
　　经CFSE检测，奥美沙坦修饰DCs组与未经奥美沙坦修饰DCs组之间的T淋巴细胞增殖反应有明显的统计学差异。奥美沙坦修饰DCs组的T淋巴细胞增殖反应明显低于未经奥美沙坦修饰DCs组(p＜0.001)。
　　4.T淋巴细胞培养上清液中细胞因子IFN-γ的检测
　　OVA免疫大鼠淋巴结源性T淋巴细胞与DCs共培养，通过ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果显示，奥美沙坦修饰的DCs组较未经奥美沙坦修饰的DCs组低表达IFN-γ。
　　结论:
　　1.在体外奥美沙坦虽没有诱导产生免疫耐受性DCs，但奥美沙坦修饰DCs后明显高表达胞内细胞因子IL-10。
　　2.奥美沙坦修饰的髓源性DCs抑制了T淋巴细胞增殖，细胞培养上清中细胞因子IFN-γ的水平降低。
　　意义:
　　我们通过在体外研究奥美沙坦是否能够诱导免疫耐受性DCs的产生，结果发现奥美沙坦没有诱导免疫耐受性DCs的产生，但却上调了胞内细胞因子IL-10水平;同时发现奥美沙坦能够抑制T淋巴细胞增殖，并降低了T细胞培养上清液中细胞因子IFN-γ的水平。因此，我们推测奥美沙坦在降低血压的同时，还可以干预免疫炎症反应。以上研究结果为临床上ARBs（奥美沙坦）的应用提供了一种新的思路和途径。

目录

声明

论文Ⅰ 亚低温对高血压性脑出血微创血肿清除术后血肿周围组织炎性因子表达的研究

摘要

符号说明

前言

资料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文Ⅱ 奥美沙坦修饰的树突细胞对T淋巴细胞免疫功能影响的体外研究

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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