过氧化物酶体增殖物激活受体γ在动脉粥样硬化中的分子作用机制

摘要

研究背景 过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是核受体超家族成员，有PPARα、PPARγ和PPARβ/δ3种亚型，这三种亚型由不同的基因编码，但它们的蛋白质结构十分相似。PPARs与配体结合后，与视黄酸类受体形成二聚体，然后与所调节基因的启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件(即PPRE，是一段DNA序列，它与增殖物结合后可以调节一些基因的表达)结合而发挥转录调控作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是PPARs中最具脂肪组织特异性的成员，它能够调节脂质代谢、脂肪细胞分化和胰岛素敏感性。 动脉粥样硬化是一种多因素疾病，可以引起心脏、脑等重要脏器缺血甚至梗死。动脉粥样硬化斑块病变的形成包括单核/巨噬细胞、T细胞的聚集，泡沫细胞的形成、平滑肌细胞的迁移和增殖，以及细胞碎片堆积、纤维帽的形成。最近研究发现PPARγ在动脉粥样硬化损伤处和泡沫细胞中都有较高的表达，并与肥胖相关的代谢性疾病，如高脂血症、胰岛素抵抗和冠心病等发病有关。 研究目的 本文拟从基因水平研究PPARγ与动脉粥样硬化的关系。首先从人群的基因多态性研究入手，了解该基因C161→T基因多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病患者冠脉病变程度和糖脂代谢的关系；然后建立心梗的动物模型，观察PPARγ激动剂马来酸罗格列酮对心肌梗死大鼠血流动力学、梗死面积、心肌细胞凋亡率的影响，研究组织PPARγ基因表达对大鼠心肌梗死的作用；再从细胞水平给予罗格列酮干预，观察其对PPARγ与ET-1表达水平的影响，了解两个基因之间的相关性，同时观察炎症因子TNF-α与PPARγ的关系，了解PPARγ对内皮功能有无保护作用以及对炎症反应的作用；最后选择siRNA方法减少PPARγ的表达量，观察ET-1的变化，从另一方面了解二者之间的关系。 研究方法 1、运用聚合酶链式反应及限制酶片段长度多态性技术分析292例研究对象(包括89例正常健康人，203例冠心病患者)中PPARγC161→T基因多态性；结合放射免疫技术检测血浆胰岛素水平，HOMA方法评价胰岛素抵抗状况，冠状动脉造影检查冠状动脉病变，采用Gensini积分评估冠脉病变的程度，以及临床常规检测项目：空腹、餐后2小时血糖、血脂、身高、体重等指标，综合分析基因频率、等位基因频率分布及不同基因型与临床资料、生化指标的关系，并对该基因突变的危险性进行评价。 2、结扎大鼠左冠状动脉主干制作心肌梗死模型，分为非罗格列酮治疗组(AMIA)和罗格列酮(5mg.kg-1/天)治疗组(AMIB)，以假手术(Sham)组作为对照组，手术过程中仅穿线绕过冠状动脉而不结扎。通过MP-150生理记录仪检测血流动力学变化，HE染色检测梗死面积，流式细胞术检测心肌细胞凋亡率，RT-PCR检测心肌组织PPARγ基因表达，观察罗格列酮对上述指标的影响。 3、采用罗格列酮干预体外培养的人正常脐静脉内皮细胞以及AngⅡ诱导的脐静脉内皮细胞24小时，通过RT-PCR、适时定量PCR(quantitativereal-timePCR)检测PPARγ及ET-1的mRNA表达量，采用Westernblot法检测PPARγ及ET-1前体的蛋白质表达水平。同时用ELISA法检测内皮细胞TNF-α的分泌量。 4、采用siRNAExpressionCassette方法干预体外培养的人正常脐静脉内皮，通过RT-PCR、real-timePCR及Westernblot法检测PPARγ及ET-1的mRNA、蛋白质表达水平。 结论 1、在中国汉族冠心病及正常人群中PPARγC161→T基因型频率分布及等位基因频率分布无显著性差异；做过冠脉造影的冠心病患者中，CC基因型患者Gensini积分明显高于CT+TT型，提示C等位基因可能与冠脉疾病严重程度相关联；PPARγC161→T与冠心病有重要的相关性，T等位基因携带者可以减少冠心病的危险性。 2、罗格列酮能有效降低大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡，减少心肌梗死面积，这可能与其增加梗死后心肌组织中PPARγ基因表达量，发挥了PPARγ对心肌细胞及局部血管的保护作用有关。 3、罗格列酮可以通过增加PPARγ的表达量在转录水平和翻译水平抑制ET-1及其前体在人脐静脉内皮细胞的基因表达，还可以抑制人脐静脉内皮细胞炎症因子TNF-α的分泌。 4、干扰RNA片段siRNAExpressionCassette1(1326)对PPARγ的基因表达有抑制作用，可以在转录水平抑制PPARγ在人脐静脉内皮细胞的基因表达，同时使ET-1基因表达上调。

目录

实验流程图

前 言

第一部分过氧化物酶体增殖物激活受体γC161→T基因多态性与冠心病的相关性研究

第二部分过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂罗格列酮对心肌梗死大鼠血流动力学、梗死面积及心肌细胞凋亡的影响

第三部分过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂罗格列酮对人脐静脉内皮细胞内皮素-1基因表达及TNF-α分泌的影响

第四部分干扰RNA片段对过氧化物酶体增殖物激活受体γ及内皮素-1基因表达的影响

讨论及总结

主要缩略词

综述 过氧化物酶体增殖物激活受体γ与代谢综合症相关疾病的关系

博士研究生在读期间所从事的研究工作及发表论文

致 谢