细胞水平高通量药物筛选的微流控芯片研究

摘要

高通量筛选是现代药物发现过程中鉴定具有特定生理活性化合物的重要技术之一。基于细胞模型的高通量筛选，能够在群体细胞水平或单细胞水平，通过单次实验，监测和定量分析多种细胞事件，为药物的初步筛选提供可靠信息。
　　传统高通量筛选利用光学仪器，在微量滴定板小孔内分析群体细胞的荧光信号。这类方法需要繁琐的样品预处理过程和机械化的溶液交换操作，难以集成环境控制系统和溶液操作系统。基于微加工技术的微流控芯片具有试剂消耗少、反应速度快、分析通量高、生物兼容性好和易于集成等诸多优点，能突破传统方法的限制，为细胞水平药物筛选提供新的研究平台。本文提出三种不同结构和功能的微流控芯片装置，为解决细胞水平药物筛选的难点问题提供新技术手段。主要研究结果如下：
　　（1）针对群体细胞长时给药刺激，发展了一种适用于细胞水平抗肿瘤药物筛选的微流控芯片，利用低流速混合扩散原理，自动生成8个药物浓度梯度。选择稳定表达Caspase-3荧光共振能量转移（FRET）探针的HeLa-CD3细胞为研究对象，采集不同时间点细胞形态和荧光变化，通过细胞内FRET荧光比率值的变化判断细胞凋亡情况，在线监测药物诱导细胞凋亡过程，从而评估最佳给药浓度和药效。
　　（2）针对单细胞长时给药刺激，设计了一种基于流体动力学的细胞捕获装置，并行监测药物诱导单细胞凋亡。该微流控芯片由分流结构阵列组成，具有高效稳定的单细胞捕获能力。细胞捕获无需任何表面修饰或施加外界电场力及机械力，因此细胞个体能维持正常生理状态。利用优化的捕获装置，能获得95％单微球捕获率以及90%单细胞捕获率。不同浓度DDP药物诱导细胞凋亡实验，证明该装置能用于高通量药物筛选分析。HeLa细胞在化学治疗剂作用下发生明显凋亡，相较于常规化疗反应更为快速。利用该方法能实时获取多种药物的IC50值。
　　（3）针对单细胞瞬时给药刺激，我们提出了一种基于气阀阱捕获细胞的药物刺激平台，实时监测细胞内钙信号响应。相较于固定不变的细胞捕获装置，可逆的气阀阱结构更为灵活，通过气压驱动其开闭，可实现细胞捕获、门控化学刺激和细胞释放一体化。利用水力门控系统输出高时空分辨的ATP毫秒脉冲，模拟精确可控的化学微环境，实时监测单细胞对瞬时药物刺激的响应。
　　综上所述，本文针对细胞水平药物筛选研究中的一些难点问题，提出了三种不同功能的微流控芯片：分别在群体细胞水平和单细胞水平，实现药物诱导细胞凋亡的实时监测和定量分析，并通过微阀控制，实现细胞捕获、门控化学刺激和细胞释放一体化，为灵活便捷的细胞水平药物筛选提供新平台。我们希望上述三种方法能成为行之有效的工具，广泛应用于细胞凋亡学研究以及药物筛选和个体化诊断治疗。

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1 绪 论

1.1 细胞概论

1.2 细胞水平药物筛选

1.3 微流控芯片

1.4 微流控芯片细胞生物学研究

1.5 本文主要研究内容

2 浓度梯度芯片监测药物诱导细胞凋亡

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 流体动力学芯片并行监测单细胞凋亡

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 气阀阱芯片高通量化学刺激细胞

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

5 结论与展望

5.1 本文研究内容与结论

5.2 本文主要创新点与展望

致谢

参考文献

附录 攻读博士学位期间发表论文目录