SIK1/CRTC2通路在高糖培养的HepG2细胞中对糖异生的调节作用

摘要

目的:
　　糖异生是指非糖前体转变为葡萄糖的过程，主要发生在肝脏，是维持空腹血糖稳定的重要机制之一。糖异生异常导致肝糖输出增多，空腹血糖升高，与代谢性疾病关系密切。早期有研究发现，环磷酸腺苷调节转录共激活因子2（cAMP regulated transcriptional co-activators，CRTC2）对调节肝细胞中糖异生作用以及维持空腹血糖的稳定起着关键性的作用；CRTC2 Ser171去磷酸化即被激活，与环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）结合，会使下游糖异生限速酶葡萄糖6磷酸酶（Glucose-6-Phosphatase，G6Pase）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate Carboxykinase，PEPCK）蛋白表达增强，促进肝脏糖异生作用，说明CRTC2-CREB复合体有诱导肝脏糖异生作用。盐诱导激酶1（Salt-inducible kinase1，SIK1）可以磷酸化CRTC2使其失活，而抑制CRTC2-CREB下游糖异生限速酶基因的表达。此外，虽然有动物实验表明盐诱导激酶在肝脏中表达，并参与糖代谢调控，尚未有高糖环境下人类SIK1基因参与肝细胞糖异生调控的相关报道。
　　因此，本实验采用体外培养的HepG2细胞，构建人SIK1基因的真核表达载体，从细胞和分子水平，对高糖环境下HepG2细胞内SIK1的活性、表达变化以及对下游糖异生通路调控进行系统的研究。
　　方法:
　　HepG2细胞在含100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素和15％胎牛血清的低糖DMEM细胞培养基（5.5mM glucose）中培养，用高糖（25 mmol/L glucose）制备模型，于刺激后收集细胞，通过RT-PCR及Western Blot检测SIK1表达及磷酸化水平；构建SIK1质粒，细胞免疫荧光法观察高糖高糖环境下细胞内生性及转染SIK1的分布及核质转移的情况。Western Blot及细胞免疫化学检测高糖环境对HepG2细胞内CRTC2-CREB复合体及其下游糖异生限速酶基因G6Pase和PEPCK表达的影响，以及高表达SIK1后HepG2细胞内糖异生限速酶基因表达的变化。
　　结果:
　　1、RT-PCR及Western Blot检测发现，与正常组相比，高糖6、12、24h组细胞内SIK1 mRNA和蛋白表达、以及SIK1磷酸化水平逐渐减少，呈时间依赖性，P＜0.05。细胞免疫荧光以激光共聚焦观察发现SIK1在低糖即正常培养环境中HepG2细胞核内外均匀表达，高糖组则SIK1表达减少，并向细胞核转移。SIK1高表达后，激光共聚焦显微镜观察到在高糖环境下SIK1由胞质向细胞核内转移。
　　2、Western Blot检测发现，与正常组相比，高糖6、12、24h组细胞内CRTC2磷酸化水平逐渐下降，而CRTC2、G6Pase、PEPCK蛋白表达量逐渐升高，呈时间依赖性，P＜0.05。细胞免疫化学显示，与正常组比较，高糖组PEPCK蛋白表达明显增强。
　　3、RT-PCR及Western Blot检测发现，相比于对照组与pGV230空载质粒对照组，pGV230-SIK1质粒转染组的SIK1 mRNA和蛋白表达水平明显增加，P＜0.05；pGV230-SIK1质粒转染组的CRTC2磷酸化水平明显升高，CRTC2蛋白表达下降，G6Pase和PEPCK表达水平亦有所下降，P＜0.05。
　　结论:
　　1、SIK1在高糖培养的HepG2细胞内的表达水平及磷酸化水平降低，并由细胞质向核移动；同时，引起CRTC2-CREB复合体的激活，下游糖异生相关基因表达升高，提示高糖环境下SIK1磷酸化水平的下降与其糖异生通路的激活相关。
　　2、高表达SIK1后，HepG2细胞内CRTC2磷酸化水平上升，CRTC2以及G6Pase、PEPCK的表达被抑制，从而使糖异生作用减弱。
　　2、高表达SIK1后，HepG2细胞内CRTC2磷酸化水平上升，CRTC2以及G6Pase、PEPCK的表达被抑制，从而使糖异生作用减弱。

目录

封面

声明

目录

英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

材料与试剂

实验方法

结果

一、高糖环境对HepG2细胞SIK1表达的影响

二、高糖环境对HepG2细胞内SIK1核质转移的影响

三、高糖环境对HepG2细胞CRTC2信号通路的影响

四、高表达SIK1对HepG2细胞CRTC2信号通路的影响

讨论

小结

参考文献

综述: G6Pase和PEPCK在肝脏糖异生中的作用及研究近况

致谢