SIK1信号通路在高糖培养HepG2细胞中的表达及对糖异生的影响

摘要

目的：转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)与下游糖异生靶基因葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)的作用是决定肝糖异生的关键环节之一.CREB的活性受CREB共激活因子2(CRTC2)激活,CRTC2在细胞核与CREB形成复合体,使CREB活化;活化的CREB在肝脏激活G6Pase和PEPCK,促进糖异生.CRTC2S171磷酸化状态与CRTC2的活性及其在细胞核与细胞质之间穿梭密切相关.在肝细胞,盐诱导激酶1(SIK1)直接磷酸化CRTC2的S171位点并使其转运出核、被隔离在细胞质中,处于未激活状态,不能与细胞核中的CREB相结合,从而有效抑制下游糖异生基因的表达.虽然动物实验表明SIK1调节肝糖代谢,但是,尚未有高糖环境下SIK1基因参与肝细胞糖异生调控的相关报道.因此,本实验采用体外培养的HepG2细胞,构建人SIK1基因的真核表达载体,从细胞和分子水平,对高糖环境下HepG2细胞内SIK1的表达变化、对CRTC2及其下游糖异生通路的调控进行研究.rn 方法：采用人肝癌(HepG2)细胞,高糖组细胞用高糖(培养基中含25mmol/L glucose)培养,设立正常糖组,培养基中含正常浓度的糖(5mmol/L glucose),细胞培养24h后收集细胞,进行后续检测.同时,构建了携带SIK1基因的重组质粒pGV230-SIK1,以及空质粒、即Vector.采用阳离子脂质体转染法转染肝细胞后加入完全培养基培养48h,之后,分别加入正常糖和高糖培养基培养24h,收集细胞,进行后续检测.主要检测指标：RT-PCR检测细胞SIK1mRNA的表达,Western Blot检测SIK1信号通路相关基因的蛋白表达及磷酸化水平;细胞免疫荧光法观察高糖刺激下细胞内生性及转染SIK1的分布及核质转移的情况;免疫化学检测高糖对HepG2细胞内糖异生基因的表达;检测细胞培养液中葡萄糖含量.rn 结果：与正常组相比,高糖6、12、241组SIK1的mRNA表达水平逐渐降低(P＜0.05);SIK1蛋白表达水平和pT182-SIK1磷酸化水平也逐渐降低(P＜0.05);CRTC2蛋白表达水平逐渐增加(P＜0.05);pS171-CRTC2磷酸化水平逐渐下降(P＜0.05);G6Pase和PEPCK蛋白表达水平均增加(P＜0.05);高表达SIK1后,相对于正常细胞对照组和pGV230空载质粒对照组,pGV230-SIK1质粒转染组pS171-CRTC2磷酸化水平增加(P＜0.05);CRTC2蛋白表达水平降低(P＜0.05);G6Pase和PEPCK蛋白表达水平均降低(P＜0.05).rn 结论：①高糖刺激能够抑制SIK1的活性,肝细胞糖异生的通路激活,导致肝细胞糖异生增多;②增加SIK1的表达可减少肝细胞过多的糖异生;③高糖环境SIK1由细胞质向细胞核转移,虽然SIK1进入细胞核,但由于其蛋白表达和反映其活性的pT182SIK1磷酸化水平降到极低,在核内无能调控生糖基因;而高表达SIK1后,SIK1向细胞核转移,入核可磷酸化目的基因,可见pS171CRTC2磷酸化水平明显上调.