Sm22α基因敲除小鼠繁育方法的改进及在宫缩乏力研究中的应用

摘要

目的：平滑肌22α（smooth muscle22α，SM22α）是一种分子量22kDa的actin结合蛋白，用于血管平滑肌细胞分化及表型转化的研究。Sm22α基因敲除（Sm22α-/-）小鼠在人类相关疾病的研究中已得到广泛应用。然而，Sm22α-/-小鼠的传统繁育方法产生的纯合型子代数量较少，且易出现宫内窘迫，引起母、胎鼠死亡，无法满足相关研究的需要。本文对Sm22α-/-小鼠的传统繁育方法进行改进，提高子代小鼠的纯合率，进而初步探讨宫内窘迫发生的机制。
　　方法：⑴采用纯合子交配方式即雄性纯合子与雌性纯合子交配，并对有分娩征兆的孕鼠实施剖腹产手术，剖出的仔鼠由 ICR雌鼠代乳。同时用传统的杂合子交配方式即雄性纯合子与雌性杂合子交配作为对照，比较两种繁育方式的雌鼠受孕率及产生仔鼠的断乳后存活率。⑵利用化学消化法提取两种交配方式产生的子代小鼠的基因组DNA，聚合酶连式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术扩增相应目的片段；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外凝胶成像仪下分析小鼠基因型并计算两种繁育方法产生子代的纯合率。⑶解剖分离野生型（Sm22α+/+）雌鼠与 Sm22α-/-雌鼠的子宫，观察比较其大体形态；通过组织冰冻切片HE染色，观察子宫壁的形态结构，应用图像分析软件计算子宫中膜平滑肌肌层相对厚度（中膜肌层厚度与子宫壁厚度的比值），进而探讨敲除Sm22α对子宫平滑肌发育的影响。⑷应用偶联荧光基团的鬼笔环肽分别对野生型及Sm22α-/-小鼠的子宫平滑肌组织中的F-actin进行冰冻切片荧光染色，荧光显微镜下观察荧光强度，进而定量分析F-actin的含量。⑸为了在细胞水平探讨SM22α在子宫平滑肌收缩中的作用，应用改良组织贴块法培养野生型及Sm22α-/-小鼠子宫平滑肌细胞，倒置显微镜下观察细胞形态及生长特点并用特异性平滑肌肌动蛋白（ smooth muscleα-actin，SMα-actin）的免疫荧光染色进行细胞鉴定。⑹为了进一步验证 SM22α在 actin聚合中的作用，分别对野生型及Sm22α-/-小鼠的子宫平滑肌细胞中应力纤维及SM22α进行荧光染色分析，观察二者的共定位情况并分析敲除 Sm22α基因对子宫平滑肌细胞中应力纤维形成的影响。⑺所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差表示，两样本均数比较采用t检验。计数资料以百分率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：①纯合子繁育方式与传统杂合子繁育方式相比，雌鼠受孕率分别为50％和60%，仔鼠断乳后存活率分别为87.70%和88.60%，且两种繁育方式相比均无统计学差异（P＞0.05）；②纯合子繁育方式与传统杂合子繁育方式产生子代的纯合子率分别为100%和47%，基本符合孟德尔遗传定律；③与野生型相比，Sm22α-/-雌鼠子宫大体形态无明显差异，但其中膜平滑肌肌层相对厚度较小，与野生型相比具有显著差异（P<0.05）；④组织荧光染色结果显示，Sm22α-/-小鼠与野生型小鼠相比子宫平滑肌纤维中细胞骨架蛋白F-actin的相对含量偏低，差异具有统计学意义（P<0.05），这表明SM22α影响actin的聚合；⑤成功培养野生型与Sm22α-/-小鼠原代子宫平滑肌细胞，倒置显微镜下观察细胞形态为梭形并呈典型的“峰-谷”样生长；特异性的SMα-actin免疫荧光染色显示，单层细胞中阳性细胞率在95%以上；⑥子宫平滑肌细胞应力纤维荧光染色结果显示，在野生型小鼠子宫平滑肌细胞中，应力纤维呈束状，平行排列，SM22α与应力纤维共定位；而Sm22α-/-小鼠的子宫平滑肌细胞中，应力纤维稀疏，呈散在分布；这表明SM22α在应力纤维形成过程中具有重要作用。
　　结论：⑴纯合子繁育方式不仅增加了子代纯合子的数量，且无需基因型鉴定。⑵Sm22α缺失可导致子宫平滑肌F-actin形成障碍，进而降低子宫平滑肌收缩性。

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前言

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 Sm22α-/-小鼠繁育方法的改进

2.2 子宫组织解剖分离观察

2.3 组织冰冻切片制备

2.4 冰冻切片HE染色

2.5 组织免疫荧光染色

2.6 子宫平滑肌细胞原代培养及鉴定

2.7 细胞免疫荧光染色

2.8 统计学处理

结果

1 Sm22α-/-小鼠繁育方法的改进

2 Sm22α影响子宫平滑肌发育

3 Sm22α影响子宫平滑肌纤维中F-actin的形成

4 Sm22α影响子宫平滑肌细胞中应力纤维的形成

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:肌动蛋白动力学与平滑肌收缩

致谢

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