SAPK/JNK介导神经酰胺诱导肿瘤细胞自噬相关基因表达及其机制

摘要

自噬(autophagy)是细胞对自身结构进行溶酶体依赖的蛋白降解的生物学过程。它以细胞内形成双层膜性结构包裹变性坏死的细胞器或胞浆蛋白为主要特征，这种双层膜结构体称为自噬小体。自噬小体与溶酶体融合并被其降解，从而令氨基酸等营养物质得到循环再利用，为细胞提供能量。自噬对于细胞维持正常的稳态环境和清除废物，重建结构起着重要作用。 肿瘤是由于细胞分化、增殖、存活等通路的失控引起的。自噬与肿瘤的发生发展关系密切。一方面，在肿瘤发生的早期，自噬可以通过清除受损细胞器、促进蛋白分解代谢、增加基因组稳定性从而发挥抑制肿瘤的作用。在多种肿瘤(如卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等)均发现自噬相关基因Beclin1的缺失，提示肿瘤细胞存在自噬能力的缺陷。我们实验室研究发现恶性卵巢癌中Beclin1和LC3(分别是酵母自噬相关基因Atg6和Atg8的哺乳动物同源基因)的表达明显较良性肿瘤低，ⅢB期结肠癌中Beclin1高表达的患者预后较好。另一方面，由于自噬作用能够帮助细胞耐受营养缺乏、避免电离辐射等损伤，尤其在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞在缺氧或营养受限的状态下，通过自噬作用降解细胞内物质，循环利用而得以继续生存，促进肿瘤细胞存活。因此自噬对于肿瘤的发生发展具有双向效应。研究阐明自噬的分子机理有助于靶向自噬的药物的研究，将会对肿瘤治疗预防具有重要意义。 神经酰胺(ceramide)是神经鞘酯类中间代谢产物，在细胞应对外源性应激环境时(撤销生长因子、缺氧、药物、放射线)，作为一种重要的第二信使，发挥重要作用，尤其与诱导细胞发生凋亡有关。而最近有报道化疗药物通过神经酰胺诱导肿瘤细胞发生非凋亡性死亡，而自噬在其中起到关键作用1，2。自噬性细胞死亡有可能成为化疗、放射治疗杀死亡肿瘤细胞的一条新途径3-5。JNK/c—Jun通路是神经酰胺诱导细胞凋亡所必需的通路。最近研究证实JNK/c—Jun通路与细胞饥饿时诱导自噬发生有关：JNK能够直接磷酸化抑制bcl—2，使其不能与自噬相关基因Beclin1的BH—3结构域结合，胞浆中游离的Beclin1蛋白增加，从而诱导自噬发生。JNK与自噬的关系非常密切，那么作为神经酰胺下游重要的信号通路，我们考虑JNK信号通路在神经酰胺诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡过程中可能发挥重要作用。 Beclin1是酵母自噬相关基因Atg6的哺乳动物同源基因，也是第一个被发现的哺乳动物自噬相关基因。在酵母中的研究发现，Atg6可作为Ⅲ型PI3K(Vps34)的变构激活剂，与Vps34、Vps15、Vps38共同组成复合物，参与自噬体的形成。因此Beclin1是一个参与自噬和调控自噬的关键基因，在很多细胞株发生自噬的模型中都发现Beclin1被诱导表达，但其诱导表达的机制目前尚未明确。 LC3是酵母自噬相关蛋白Atg8的哺乳动物同源基因，LC3翻译后经修饰形成主要位于胞浆中的LC3-Ⅰ，自噬发生时，LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺(PE)结合，定位于自噬体膜上，即LC3-Ⅱ。它在自噬小体的延伸和闭合过程中均发挥重要功能，其作为自噬体膜的重要组份，对于自噬的产生和检测起着不可替代的作用。目前对于LC3调控的研究主要集中在转录翻译后的修饰水平，也有部分研究发现一些信号通路参与LC3基因的表达调控。在骨骼肌细胞中发现转录因子Foxo3a能够结合在LC3启动子上触发其表达。U2OS细胞株过表达E2F1，可以诱导LC3表达。在自噬中被报道激活的JNK信号通路，其下游底物包含众多转录因子，如c—Jun、ATF2、Elk1、Smad7。JNK通路能否通过转录因子介导自噬相关基因的表达，目前还不十分清楚。本研究主要探讨JNK是否介导神经酰胺诱导肿瘤细胞自噬以及对自噬相关基因表达的调控机制。 方法：通过台盼蓝排除试验和流式细胞术的方法检测神经酰胺诱导鼻咽癌株CNE2和肝癌细胞株Hep3B的死亡率和凋亡率。应用免疫荧光、GFP—LC3转染细胞和免疫印迹方法(Western Blot)检测细胞自噬、JNK信号通路激活变化，以及自噬相关基因Beclin1和LC3的蛋白表达水平。通过RT—PCR方法检测鼻咽癌细胞株CNE2和SUNE1的LC3 mRNA水平变化。应用特异性小分子抑制剂SP600125和siRNA瞬时转染方法检测JNK信号通路抑制对于LC3在mRNA和蛋白水平的影响。应用染色体免疫共沉淀(CHIP)检测转录因子c—Jun与LC3启动子是否直接结合触发表达。构建LC3启动子荧光素酶报告基因；应用定点突变法构建突变型LC3启动子荧光素酶报告基因，通过检测荧光素酶活性，来观察神经酰胺诱导LC3启动子转录活性变化，并确定LC3是否为c—Jun的靶基因。 结论： 1)神经酰胺可以通过激活JNK/c—Jun信号通路，促进肿瘤细胞发生自噬性细胞死亡。 2)神经酰胺诱导自噬相关基因Beclin1和LC3表达。 3) JNK磷酸化激活的转录因子c—Jun，能直接结合在自噬相关基因LC3的启动子上，触发LC3转录表达。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1.自噬的概念与自噬信号转导机制研究的意义

2.自噬的分子机制

3.自噬相关基因与自噬的调控

4.神经酰胺与JNK信号通路

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、神经酰胺诱导鼻咽癌细胞发生非凋亡性死亡

二、神经酰胺诱导肿瘤细胞自噬性死亡

三、神经酰胺激活JNK对自噬的影响

四、神经酰胺诱导自噬相关基因表达

五、JNK激酶抑制阻断神经酰胺诱导LC3表达

六、转录因子c-JUN结合LC3启动子直接介导神经酰胺上调LC3基因转录

七、神经酰胺介导转录因子Foxo3a转位。

讨论

参考文献

附录

致谢