细胞因子佐剂对犬透明带3DNA疫苗免疫小鼠抗生育效果研究

摘要

由于缺乏有效的控制手段，近几十年来全世界范围内流浪动物的数量在快速的增加，并带来了一系列的生态和环境问题，因此，如何有效且人道的控制它们的种群数量迫在眉睫。哺乳动物受精过程中，卵子表面的透明带3（ZP3）蛋白作为精子初级受体，参与精子与卵子的结合并诱发顶体反应。ZP3特异性抗体能够与天然的ZP3结合从而阻断精卵结合导致不育长期以来，人们尝试利用不同类型的不育疫苗、发送途径及免疫佐剂增强ZP3疫苗的免疫反应，以开发出高效的避孕疫苗。DNA疫苗是一种安全、廉价、易于生产及保存的疫苗类型，在病毒性疾病的预防和控制方面得到了广泛的应用。研究表明，DNA疫苗虽然能够激起全面的免疫应答，但其存在的问题是较弱的免疫原性，往往会导致控制及预防效果不理想。本实验室前期的研究结果表明，添加佐剂和发送途径的方式能够有效的激发机体产生全面，有效且持久的免疫反应，因此，为了控制流浪犬的种群数量，以犬ZP3为靶抗原，制备DNA疫苗，并筛选能够改善其免疫原性，增强抗生育效果的佐剂，从而达到控制城市流浪犬数量的目的。
　　增强树突状细胞（dendritic cells,DCs）对DNA疫苗的递呈效率，是提高DNA疫苗免疫原性的关键。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）能够促进包括DCs在内的抗原递呈细胞（antigen presenting cells,APCs）对DNA疫苗的加工递呈，继而影响疫苗免疫反应的强度及类型。因此，本研究构建了鼠GM-CSF重组真核表达载体，通过尾静脉注射方式转染小鼠并用RT-PCR方法检测，确认了GM-CSF重组质粒在动物细胞中的有效表达。为验证GM-CSF对包括DCs在内的APCs递呈抗原活性的影响,将GM-CSF提前4d或同时与CZP3 DNA疫苗肌肉注射小鼠，检测共刺激因子CD80、CD83、CD86的表达情况。结果表明，GM-CSF能够促进肌肉注射部位及脾脏组织中共刺激因子的表达，GM-CSF与CZP3 DNA疫苗同时注射时共刺激因子表达水平最高。因此，GM-CSF能够促进APCs的成熟，增强DNA疫苗的免疫原性，GM-CSF和CZP3 DNA疫苗同时注射的共免疫策略可以用于后续不育疫苗的研究。
　　此外，由2型辅助性T细胞（type2 T helper cell,Th2）分泌的白细胞介素-5(interleukin-5, IL-5)在诱导体液免疫方面表现突出。为了探究GM-CSF和IL-5作为免疫不孕佐剂改善犬透明带3 DNA疫苗免疫原性，增强免疫反应及并抗生育可行性。将重组真核质粒pcDNA3-IL-5和pcDNA3-GM-CSF作为pcDNA3-CZP3佐剂，采用电脉冲单独或者是联合的方式免疫雌性BALB/C小鼠。，其中 pcDNA3-GM-CSF和pcDNA3-C ZP3+pcDNA3-GM-CSF+pcDNA3-IL-5免疫组效果最为明显(P<0.01）。不同免疫组血清中IL-4和IFN-γ含量的检测结果表明，细胞因子作为免疫佐剂在不同程度上都增强了被免疫小鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应的强度，pc DNA3-GM-CSF+pc DNA3-CZP3免疫组，pcDNA3-GM-CSF+pcDNA3-IL-5+pcDN A3-CZP3免疫组的IL-4和IFN-γ的含量都和极显著高于（P<0.01）对照组。脾脏T细胞增殖实验结果表明，pcDN-A3-IL-5、pcDNA3-GM-CSF、和pcDNA3-CZP3+pcDNA3-GM-CSF免疫组的脾脏T细胞增殖显著（P<0.05）和极显著的（P<0.01）高于对照组。产仔率数目和抗体滴度之间的斯皮尔曼相关性分析结果表明，pcDNA3-GM-CSF+pcDNA3-CZP3免疫组抗体水平小鼠的生育率之间的负相关性最好，pcDNA3-GM-CSF+pc DNA3-IL-5+pcDNA3-CZP3免疫组抗体水平小鼠的生育率之间的负相关性次之。与pcDN A3和pcDNA3-CZP3免疫组相比，窝崽数分别下降了16%、27%、44%和68%以及13%、33%和62%。
　　为了检测血清中CZP3抗体与卵细胞结合的能力，以及这种结合对受精产生的实际影响，并探讨它与抗生育之间的联系。采用间接免疫荧光和体外受精的方法进行了验证。间接免疫荧光实验结果表明，小鼠卵细胞表面的荧光强度和致密度与血清中抗体水平呈现明显的正相关，并且抗体滴度和卵细胞结合效果较好的免疫组，pcDN-A3-IL-5+pcDNA3-CZP3pcDNA3-GM-CSF+pcDNA3-CZP3和pcDNA3-GM-CSF+pcDNA-3-IL-5+pcD NA3-ZP3受精率都发生了显著和极显著的降低，与pcDNA3和pcDNA3-CZ P3免疫组相，比分别下降了18%、23%、49%和66%以及17%、33%和59%。这与小鼠生育率结果也是一致的。虽然，这些结果对于解释抗体通过发挥阻断效应降低生育率的理论具有片面性，但在它们在一定程度上证明了了增强体液免疫反应对于抗生育的必要性。结论：GM-CSF可以促进抗原递呈细胞的成熟，作为佐剂增强了CZP3 DNA疫苗的体液免疫反和细胞免疫反应，显著的降低了免疫小鼠的窝崽数。当GM-CSF联合IL-5作为CZP3 DNA疫苗佐剂可进一步提高抗体水平并降低免疫小鼠的窝崽数。因次可以确定GM-CSF和IL-5联合使用作为今后犬类实验的最佳策略。

目录

第一部分 文献综述

第一章 卵透明带不育疫苗的研究进展

1不同ZP疫苗类型及其免疫不育的效果

2 细胞因子佐剂对DNA疫苗的影响

3 增强DNA疫苗粘膜免疫原性

4 结论与展望

参考文献

第二章 本研究的目的和意义以及拟解决的问题

1 本研究的目的和意义

2 本研究拟解决的问题

部分 实验部分

第一章 GM-CSF对抗原递呈细胞成熟及富集的影响

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

第二章 分子佐剂对小鼠抗生育效果的研究

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

第三章 血清CZP3抗体体外免疫不孕效果的研究

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

第三部分 结论与展望

结论

展望

第四部分 附录

附录1 英文缩略语

附录2 主要实验仪器

致谢

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