苏云金芽孢杆菌cry1Ab22基因的克隆与原核表达

摘要

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Berliner，简称Bt)是目前应用最广的一类微生物杀虫剂，在过去的30多年中得到广泛的研究和应用。Bt的主要杀虫活性与其携带的编码ICPs(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)的cry基因密切相关，因此，cry基因工程研究便成为近几年研究的热点。自Schnepf和Whiteley(1981)分离克隆了第一个Bt cry基因，到目前为止，国际上已经克隆了407种杀虫蛋白基因，但是随着Bt应用的不断扩大，Bt ICPs基因均在不同程度上引发了昆虫的抗性，寻找新的高毒力菌株及基因是解决昆虫抗性问题的有效途径之一。 本研究利用PCR-RFLP法对苏云金芽孢杆菌新菌株S249的cry1型基因进行鉴定，结果显示其含有cry1Aa/cry1Ag、cry1Ab、cry1B基因，并根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计引物对P-1，从苏云金芽孢杆菌S249中扩增得到cry1Ab的全长基因，克隆到pGEM-T Easy载体上。通过引物步行法测定该基因长3633bp，其中开放阅读框(ORF)长3468bp，编码1155个氨基酸；经ExPASy分析，初步预测其蛋白质分子量为130.7kDa，等电点pI 5.04。序列比较结果表明，该基因与其它crylAb基因存在6～58个氨基酸的差异，已在GenBank中登录，登录号为Eu220269，并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。将cry1Ab22基因克隆到表达载体pMAL-c2X上，得到重组质粒pM1a，然后转化到大肠杆菌TB1中，利用IPTG诱导进行表达，最佳IPTG诱导浓度为0.5mM，最佳诱导时间为4h，目的蛋白约占总蛋白的17％。经SDS-PAGE检测，发现转化菌株TB1能正确表达约170kDa的融合蛋白。对表达的cry1Ab22蛋白进行生物测定，结果表明，cry1Ab22蛋白对小菜蛾.Plutella xylostella 3龄幼虫的LC50为225.1μg/ml。 新cry基因的克隆，不但为cry基因家族增添了新成员，而且为构建新型转基因工程菌和转基因植物，提供了基因材料。

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1苏云金芽孢杆菌概述

1.2苏云金芽孢杆菌杀虫毒素

1.2.1苏云金芽孢杆菌杀虫毒素种类

1.2.2苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的分类

1.2.3苏云金芽孢杆菌cry基因的鉴定

1.2.4苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的分子结构及其功能

1.2.5 Bt杀虫晶体蛋白的作用机理

1.3苏云金芽孢杆菌的应用

1.4本研究的目的及意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2培养基

2.1.3试剂

2.2试验方法

2.2.1苏云金杆菌DNA模板的制备

2.2.2 DNA的PCR扩增

2.2.3目的片段与克隆载体的连接

2.2.4感受态细胞的制备(CaCl2法)

2.2.5转化

2.2.6重组质粒的筛选与鉴定

2.2.7序列测定及分析

2.2.8 E.coli质粒的提取

2.2.9双酶切

2.2.10琼脂糖凝胶电泳回收

2.2.11 T4 DNA-lignase连接

2.2.12 pMAL-c2X-crylAb22表达载体的鉴定

2.2.13目的基因的诱导表达及优化

2.2.14蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳

2.2.15生物测定

第三章结果与分析

3.1苏云金芽胞杆菌S249 cryl型基因的鉴定

3.1.1苏云金杆菌质粒DNA提取样品的检测

3.1.2 cryl型基因的鉴定

3.2苏云金芽胞杆菌S249中的crylAb基因的克隆及序列测定

3.2.1利用P-1引物对进行长片段PCR扩增及其产物的克隆

3.2.2克隆的crylAb基因全序列

3.3 crylAb22基因在E.coli中的表达

3.3.1引物设计

3.3.2利用引物P-1Ab进行PCR扩增及产物克隆

3.3.3含crylAb22基因表达质粒的构建

3.3.4 crylAb22基因的表达

3.3.5 crylAb22产物的活性及生物测定

第四章讨论

4.1 Bt S249质粒DNA的提取

4.2 RFLP图谱的分析

4.3 Bt-cry全长基因PCR扩增

4.4关于感受态细胞

4.5 crylAb基因的多样性

4.6结论与未来工作设想

4.6.1结论

4.6.2未来工作设想

参考文献

附录 cry1Ab1-22氨基酸序列比对结果

致谢

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