牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的研制及其在牙鲆淋巴囊肿病研究中的应用

摘要

本文在国家自然科学基金项目的资助下，从淋巴囊肿病毒(LCDV)免疫的牙鲆抗血清中分离提取牙鲆免疫球蛋白(Ig)；筛选获得抗牙鲆Ig的单克隆抗体，并进行了特性分析；应用单克隆抗体研究了牙鲆各组织中表面抗体阳性(SmIg<'+>)细胞的分布；通过检测牙鲆血清中抗LCDV的特异性抗体水平，初步探讨了应用牙鲆Ig的单克隆抗体进行牙鲆淋巴囊肿病的早期诊断及疫苗免疫效果评价的可行性。具体研究结果如下： (1)牙鲆Ig的分离提取。分离纯化LCDV，免疫健康牙鲆，制备抗血清。牙鲆抗血清经50％饱和硫酸铵盐析后，应用AKTA prime蛋白质纯化系统，通过HiTrap Igm Purification Column；HiTrap Protein A Sepharose Column和HiTrapDEAE Sepharose Fast Flow Column三种预装层析柱纯化牙鲆Ig，并进行了分子量的初步测定。结果表明，HiTrap Igm Putification Column不适合于牙鲆Ig的纯化；HiTrap Protein A Sepharose Column可特异性的分离牙鲆Ig，纯度高，但产量低；HiTrap DEAE Sepharose Fast Flow Column可分离获得大量的牙鲆Ig，但混有少量杂蛋白。根据单抗制备的要求和特点，最后选择HiTrap DEAE Sepharose FastFlow Column进行牙鲆Ig的大量纯化，供单克隆抗体制备使用。通过SDS-PAGE检测分析得出纯化获得牙鲆Ig的重链和轻链分子量分别为74kDa和24kDa。 (2)抗牙鲆Ig单克隆抗体的制备及特性分析。以纯化的牙鲆Ig为抗原免疫Balb/C小鼠，采用单克隆抗体技术经细胞融合、筛选、有限稀释法克隆共获得了10株抗牙鲆Ig的单克隆抗体(2D8、2H1、1E1、1C12、2E6、1E7、1811、4D1、2A7、2E8)。抗体的亚级份测定结果表明：单抗2D8，1E1，1C12，2E6，2A7和2E8属IgG亚型。单抗2H1，1E7，1811和4D1属IgM亚型。采用Western blot方法对单克隆抗体结合的抗原决定簇进行了分析，结果显示：单抗2D8、2H1，1C12，1E7，1B11，2E6，4D1，2A7和2E8识别的抗原决定簇均位于牙鲆Ig的重链(74kDa)上，单抗1E1识别的抗原决定簇同时位于牙鲆Ig的重链(74kDa)和轻链(24kDa)上，单抗2E6没有反应条带。通过间接免疫荧光对牙鲆淋巴细胞表面Ig进行了检测，结果表明所制备的10株单抗均能与牙鲆淋巴细胞表面Ig反应。 (3)牙鲆各组织中表面抗体阳性(Smlg<'+>)细胞的分布。应用抗牙鲆Ig的单克隆抗体(2D8)通过流式细胞术对牙鲆各组织中的smIg<'+>细胞比例进行了分析，发现各组织中的SmIg<'+>细胞的比例不同，分别为外周血细胞(40.48％)，脾(17.32％)和前肾(9.67％)。 (4)牙鲆血清中抗LCDV特异性抗体水平的检测。应用抗牙鲆Ig的单克隆抗体(2D8)通过间接ELISA法，检测了外观健康无症状、患淋巴囊肿病，具明显肿瘤、患淋巴囊肿病，处于恢复期、免疫接种LCDV灭活疫苗四组牙鲆血清中抗LCDV的特异性抗体水平。结果表明，无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低(平均OD值为0.092)，个别鱼体偏高，推测其已感染LCDV，处于潜伏期，症状还未显现出来；患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高(平均OD值为0.165)；患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平更高(平均OD值为0.231)，说明处于恢复期的牙鲆对LCDV具有一定的免疫力；免疫接种LCDV灭活疫苗后牙鲆血清中特异性抗体水平明显升高(丛0.086上升至0.395)，由此初步判断LCDV灭活疫苗对牙鲆免疫具有一定保护性。

目录

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摘要

英文文摘

1前言

1.1鱼类免疫系统的研究概况

1.2鱼类免疫球蛋白(Ig)的研究进展

1.3单克隆抗体技术在水产养殖中的应用

1.4鱼类淋巴囊肿病的研究概况

2牙鲆血清中免疫球蛋白的纯化

2.1淋巴囊肿病毒的纯化

2.2牙鲆抗血清的制备

2.3牙鲆血清中免疫球蛋白的纯化及分子量的测定

3牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性分析

3.1牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的制备

3.2抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体类型的鉴别

3.3牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体作用的抗原决定簇分析

3.4间接免疫荧光和流式细胞术研究牙鲆体内SmIg阳性细胞

4牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的应用

4.1患淋巴囊肿病牙鲆血清中特异性抗体的检测

4.2牙鲆接种LCDV灭活疫苗后血清中特异性抗体水平的变化

结 语

参考文献

致 谢

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