靶向HIV和AIV包膜蛋白跨膜亚基的病毒进入抑制剂研究

摘要

艾滋病和禽流感成为当今中国乃至全世界有深远影响的重大流行疾病，是当前人类健康面临的重大威胁，但一直以来缺乏有效的治疗药物和疫苗。与SARS冠状病毒（SARS-CoV）相似，人类免疫缺陷病毒（HIV）和禽流感病毒（AIV）均为Ⅰ型包膜病毒，采用相似的病毒-宿主细胞膜融合机制，即病毒表面糖蛋白结合到宿主细胞受体后，启动病毒融合蛋白的一系列构象变化。包膜病毒进入靶细胞的过程需要病毒膜糖蛋白的介导，这一类型病毒的包膜蛋白一般都具有两个亚基，其中不跨膜的亚基（如HIV的gp120、AIV的HA1等）具有与靶细胞膜上病毒受体相结合的位点，而跨膜亚基（如HIV的gp41、AIV的HA2等）则介导病毒膜与靶细胞膜的融合。以上述研究为基础设计的病毒进入抑制剂，可以在病毒包膜糖蛋白中间体构象形成的短时间内，高效、特异地竞争结合其配体，从而阻止包膜糖蛋白的进一步折叠，达到抑制病毒入侵的目的，为病毒疾病的防治提供了新思路和策略。 HIV是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，主要感染CD4+T淋巴细胞，特征性的引起CD4+T细胞逐步减少和进行性免疫缺陷，最后导致艾滋病（获得性免疫缺陷综合征），引起机会性感染并最终导致死亡。病毒与宿主免疫细胞的相互作用是影响疾病发展的重要因素。在HIV感染导致的AIDS疾病进展过程中，T细胞活化是一把双刃剑。一方面CD4+T细胞的活化在清除病毒过程是非常必要的，成熟的CD4+Th细胞是抗病毒免疫的关键因素。另一方面，HIV膜蛋白（Env）能结合CD4+受体，在CD4+T细胞中复制，由于病毒颗粒的持续表达，HIV感染导致T细胞增殖增加，T细胞活化后又可借助自身表达的凋亡受体与配体的结合，使已发生特异性克隆扩增的T细胞发生自身凋亡而数量下降。因此，适度的T细胞活化可能作为HIV治疗的一种方法和策略。 为此，本课题根据在HIV和SARS病毒进入抑制剂研究领域积累的经验，以AIV和HIV作为研究对象，为研究AIV病毒进入抑制剂和HIV杀微生物剂奠定研究基础。 （1）靶向H5N1禽流感病毒血凝素亚基HA2的病毒进入抑制剂研究：建立抑制H5N1型AIV六螺旋束结构和N-端帽子结构形成的高通量筛选模型，并建立H5N1型禽流感假病毒模型，筛选小分子化合物库，再利用活病毒感染MDCK模型和活病毒感染小鼠模型，验证筛选出的小分子化合物的抗病毒活性，寻找能有效抑制H5N1型AIV进入靶细胞，且具有良好膜通透性的活性分子，为开发抗禽流感病毒进入抑制剂类药物奠定基础。 （2）抗HIV多肽VIR576对抗原特异性T细胞活化的影响：采用T细胞活化的检测方法，研究VIR576对抗原特异性T细胞活化的影响和作用机制。由于HIV感染与T细胞关系密切，研究将有助于初步探讨VIR576与T细胞的关系，并分析其对HIV病毒感染的可能影响，有助于评价VIR576作为抗HIV杀微生物剂的可能性和机制。 第一部分、靶向H5N1禽流感病毒血凝素亚基HA2的病毒进入抑制剂研究。 目的： 建立抑制H5N1型AVI六螺旋束结构和N-端帽子结构形成的高通量筛选方法，并建立H5N1型禽流感假病毒模型，筛选小分子化合物库，得到小分子抗AIV化合物，再利用H5N1型活病毒感染MDCK模型和H5N1型活病毒感染小鼠模型进行验证，寻找能有效抑制H5N1型AIV感染的活性分子，研究其抗禽流感的作用。 方法： 1.合成衍生于H5N1高致病性禽流感病毒血凝素亚基HA2的多肽，包括N-多肽（N29，aa77～aa105）、C-多肽（C19，aa110～aa128）以及用FITC标记的荧光C-多肽、生物素标记的N-末端帽子多肽（N8，aa34～aa37）、FITC标记的C-末端帽子多肽（C8，aa173～aa176）。通过FLISA、荧光天然凝胶电泳、分子筛高效液相色谱等方法研究两组多肽间的相互作用，尝试建立阻止六螺旋束结构形成的荧光高通量筛选方法、抑制N-端帽子形成的高通量筛选方法、阻止六螺旋束结构形成的荧光天然凝胶电泳和分子筛高效液相色谱。 2.建立细胞水平的H5N1型禽流感假病毒活性检测方法：禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）的包膜蛋白有两个，分别为血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA），将表达这两个包膜蛋白的质粒与pNL43-Luc.R-E-（带有荧光素酶报告基因的HIV-1基因）共转染至293 T细胞后，细胞表达禽流感病毒包膜蛋白（HA、NA）和HIV-1颗粒，它们可被组装成为HA-NA/HIV假病毒，用来筛选作用于禽流感病毒包膜蛋白的化合物。 3.抗流感药物活性验证：应用H5N1型活病毒感染MDCK细胞模型和H5N1型活病毒感染Balb/c鼠模型进行活性验证，检测药物对病毒感染的MDCK细胞的保护作用及对MDCK细胞的毒性（CPE观察及XTT法检测）、药物对病毒感染动物的死亡保护作用等，评价抗流感病毒新药。即XTT法检测药物对MDCK细胞的毒性，CPE法（细胞病变）检测药物对流感病毒感染的MDCK细胞的保护作用，流感病毒对小鼠半数致死量（LD50）的测定和药物对流感病毒感染小鼠的死亡保护试验。 4.建立小鼠血浆中ARC-36的HPLC检测方法，研究ARC-36在小鼠体内的药代动力学，考察小鼠腹腔注射ARC-36的急性毒性。 结论： 1.人工合成的衍生于H5N1高致病性禽流感病毒血凝素亚基HA2的多肽没有抑制H5N1禽流感的活性。采用FLISA、圆二色谱、荧光天然凝胶电泳、分子筛高效液相色谱等技术发现，各组多肽之间没有相互作用，无法建立抑制H5N1型AVI六螺旋束结构和N-端帽子结构形成的高通量筛选方法。 2.建立的假病毒体系HA-NA/HIV可高效感染多种细胞系，筛选出的化合物ARC-36抑制H5N1禽流感假病毒活性较高，且作用于病毒进入阶段。 3.ARC-36对H5N1型禽流感病毒有较强的抑制作用，且ARC-36滴鼻或腹腔注射均可以延长小鼠的存活时间，但对小鼠存活率没有明显的保护作用，可能原因是ARC-36的半衰期较短。 4.本实验建立的小鼠血浆中ARC-36的HPLC测定法操作简便、快速、准确，可用于ARC-36的体内定量分析。小鼠腹腔静脉注射ARC-36后血浆C-t曲线呈二室模型，ARC-36在血中清除迅速。小鼠腹腔注射ARC-36具有一定的安全性。 第二部分、抗HIV多肽VIR576对抗原特异性T细胞活化的影响及机制研究。 目的： 采用T细胞活化的检测方法，研究VIR576对抗原特异性T细胞活化的作用，探讨其对T细胞活化及HIV免疫的影响；并用生物物理等方法研究VIR576与TCR-TMD之间的相互作用，评价VIR576作为HIV杀微生物剂的可能性和机制。 方法： 1.MOG35-55体外刺激抗原特异性T细胞系A2b细胞，[3H]脱氧胸苷摄入法测定VIR576对A2b细胞活化的影响；OVA体外刺激分离的DO11.10小鼠抗原特异性T细胞，CCK-8法测定VIR576对其活化的影响；刀豆蛋白（ConA）或抗鼠CD3抗体体外刺激非抗原特异性小鼠T细胞，CCK-8法测定VIR576对其活化的影响；采用免疫磁珠两步法分离小鼠脾组织CD4+CD25-T细胞，CCK-8法测定VIR576对其活化的影响。 2.用溶血试验、溶血抑制实验、FRET、FLISA、竞争性FLISA等方法检测VIR576与TCR-TMD之间的相互作用，并研究其主要的结合区域。多肽TCR-TMD加入到人红细胞悬液，在405 nm处测吸光度，考察多肽TCR-TMD的插膜作用；多肽VIR576或VIR-scram与多肽TCR-TMD孵育后加入到人红细胞悬液，考察其对多肽TCR-TMD插膜作用的抑制作用。TCR-TMD包被到96孔酶标板里，加入相应浓度的Rho-VIR576，；或者加入Rho-VIR576和未标记的VIR576，读取各孔荧光密度值，考察TCR-TMD与VIR576之间的相互作用。用FRET技术考察TCR-TMD的核心序列CP与VIR576的相互关系，将CP-NBD加入到LUV溶液，在467 nm波长激发，500 nm-600 nm波长发射，再加入Rho-VIR576，考察其能量转移（FRET）。 3.BALB/c小鼠脾细胞用抗鼠-CD3抗体刺激72小时后，4%多聚甲醛冰上固定，加入1：50稀释的兔抗鼠CD4抗体，再加入1：50稀释的标记的羊抗兔IgG，在孵育的最后5 min加入Rho-VIR576。细胞用PBS洗三次，在激光共聚焦显微镜下观察VIR576在T细胞细胞膜的定位和与TCR分子的共分布情况。 结论： 1.VIR576能抑制抗原特异性T细胞活化，也能反转FP介导的抗原特异性T细胞活化，但对非抗原特异性T细胞活化没有作用。 2.溶血实验显示VIR576能抑制TCR-TMD介导的红细胞溶血，FLISA及竞争性FLISA法结果提示VIR576能与TCR-TMD特异性的结合，FRET实验证实VIR576能与TCR-TMD的主要区域CP结合。 3.VIR576能结合到活化的T细胞膜表面，且与CD4分子结合，间接证明其能与T细胞表面的TCR结合。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词

声明

第一部分靶向H5N1禽流感病毒血凝素亚基HA2的病毒进入抑制剂研究

前言

一、抗流感病毒药物研究现况

二、病毒进入抑制剂研究进展

三、H5N1禽流感病毒血凝素亚基HA2的结构

四、靶向H5N1禽流感病毒血凝素亚基HA2的病毒进入抑制剂

五、本文研究工作的主要内容及意义

第一章衍生于H5N1高致病性禽流感病毒HA2的多肽之间相互作用的研究

一、实验材料及仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、小结

第二章抗H5N1禽流感病毒的活性检测的假病毒体系

一、实验材料及仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、小结

第三章哌啶类化合物ARC-36抗流感病毒的活性研究

一、材料和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、小结

第四章ARC-36在小鼠体内的药代动力学

一、材料与仪器

二、 实验方法

三、实验结果

四、小结

讨论

第二部分抗HIV多肽ⅥR576对抗原特异性T细胞活化的影响和机制研究

前 言

一、艾滋病感染的现状和杀微生物剂的发展

二、HIV进入抑制剂可作为杀微生物剂开发

三、HIV与T细胞活化和粘膜免疫

四、本研究工作的主要内容及意义

第一章抗HIV多肽VIR576对抗原特异性T细胞活化的影响

一、实验材料及仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、小结

第二章抗HIV多肽VIR576对抗原特异性T细胞活化的机制研究

一、实验材料及设备

二、实验方法

三、实验结果

四、小结

讨论

结论

参考文献

文献综述 靶向血凝素的流感病毒进入抑制剂研究进展

论文发表情况

致谢

统计学合格证明