水通道蛋白4对中枢神经传导的影响及其与帕金森病的相关性研究

摘要

水通道蛋白4对中枢神经传导的影响及其与帕金森病的相关性研究水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一类广泛存在于真核生物细胞膜上、选择性高效转运水分子的特异孔道，对机体的水液平衡和细胞微环境的稳定发挥重要调节作用。其中，AQP4(aquaporin-4，AQP4)是脑内含量最丰富、转运效率最高的AQPs亚型，主要表达于星形胶质细胞和室管膜上皮细胞，尤其富集于朝向血管面和软脑膜面的胶质细胞膜区。早期应用RNAi技术即发现，降低星形胶质细胞上AQP4表达能直接影响细胞的发育、增殖及多种转运体和受体的表达。新近的研究表明AQP4基因敲除可致星形胶质细胞的多种重要生理功能异常，包括空间钾缓冲能力显著下降、细胞骨架蛋白的表达异常及迁移和修复能力减弱。因此，AQP4不仅是脑内一种特异性的水转运孔道，而且可能调节星形胶质细胞的功能，广泛参与脑内微环境的维持、神经传导等重要生理功能的调节。大量的研究已经表明AQP4在脑水肿的病理过程中发挥重要的调节作用，与脑损伤、脑肿瘤及脑缺血的发生、发展有着密切的关系。但AQP4是否参与脑内神经传导，并进一步影响神经退行性疾病的发生发展，目前尚未见报道。 帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种严重影响老年人的身心健康和生活质量的中枢神经退行性疾病。尽管其确切病理机制目前尚不清楚，但来自PD患者和动物病理模型的研究均表明星形胶质细胞在PD的发生、发展过程中发挥十分重要的作用。研究表明，活化的星形胶质细胞能通过分泌各种神经营养因子，释放突触发生所必需的各类细胞介质，清除活性氧及过多的谷氨酸，促进成体干细胞的神经再生。此外，抑制星形胶质细胞的凋亡已证实对PD等神经退行性疾病具有重要的保护作用。因此，靶向于星形胶质细胞功能的调节已经成为PD等神经退行性疾病神经保护的重要策略。本文工作应用本实验室自行制备的AQP4基因敲除鼠，首先发现AQP4参与脑内神经传导的调节，在整体、细胞和分子水平研究阐明AQP4与PD发生、发展相关，并揭示AQP4通过调节星形胶质细胞功能参与PD病理改变的作用机制。研究结果不仅为AQP4神经生物学的研究开拓新领域，深化对AOP4生理和病理功能的认识，而且揭示AQP4是星形胶质细胞功能调节的重要靶点，为PD临床治疗学的突破和研发理想的神经保护剂提供有益的靶标。 第一部分 AQP4基因缺失对小鼠中枢神经传导的影响 一、 AQP4基因缺失对小鼠基础状态下脑内神经递质水平的影响 目的：研究、阐明AQP4是否参与脑内神经传导的调节。 方法：制备AQP4基因敲除小鼠后，取2月龄成年野生型和基因敲除型小鼠断颈处死，冰上迅速分离皮层、海马、纹状体与下丘脑，匀浆、离心、取上清；应用高效液相色谱．荧光法测定匀浆液中氨基酸类神经递质(天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、牛磺酸及γ-氨基丁酸)水平；应用高效液相色谱．电化学法测定单胺类神经递质(多巴胺、双羟苯乙酸、高香草酸、5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸及去甲肾上腺素)的水平。 结果：AQP4基因缺失后，1)在雌雄小鼠各脑区天冬氨酸均显著下降，谷氨酰胺含量则明显增高，而谷氨酸的增加和甘氨酸的降低分别仅见于雌性和雄性小鼠脑内，牛磺酸和γ-氨基丁酸无显著改变；2)在雄性小鼠脑内，5-羟色胺能神经递质水平在所有被检测的脑区均显著增加，多巴胺能神经递质水平则在皮层和纹状体出现增高，而去甲肾上腺素水平的上升仅见于皮层；3)在雌性小鼠脑内，5-羟色胺能神经递质水平在皮层和下丘脑显著增加，多巴胺能神经递质水平则在各脑区均未见异常，而去甲肾上腺素水平的增加也仅见于皮层。 结论：AQP4参与小鼠脑内神经传导的调节，并且这种调节作用具有性别和脑区特异性。 二、 AQP4基因缺失对高钾刺激的小鼠纹状体神经递质释放的影响 目的：研究、阐明在高钾刺激时AQP4是否参与对纹状体神经递质释放的调节。 方法：1)3月龄雄性野生型和基因敲除型小鼠进行立体定位手术，在其右侧纹状体埋置套管，手术后分别恢复24 h或7 d，进行微透析实验：正常透析液平衡100 min后，100mM高钾灌流100 min，再以正常透析液平衡160 min，其间连续收集每20 min的灌流液；2)应用高效液相色谱．荧光法测定灌流液中氨基酸类神经递质(天冬氨酸、谷氨酸、牛磺酸及γ-氨基丁酸)水平；应用高效液相色谱-电化学法测定单胺类神经递质(多巴胺、双羟苯乙酸、高香草酸及5-羟吲哚乙酸)的水平。 结果：当微透析手术后24 h，AQP4基因缺失对基础状态和高钾刺激时灌流液中的氨基酸类(天冬氨酸、谷氨酸及γ-氨基丁酸)和单胺类(多巴胺、双羟苯乙酸、高香草酸及5-羟吲哚乙酸)神经递质释放水平均无显著影响。当手术后7 d，尽管AQP4基因缺失对纹状体灌流液中氨基酸的基础水平无显著影响，但能增加高钾刺激时天冬氨酸、谷氨酸及γ-氨基丁酸的释放水平；AQP4基因缺失能显著增加纹状体多巴胺及其代谢产物的基础水平，却显著降低这些单胺类神经递质对高钾刺激的反应性。在24 h和7d时，AQP4基因缺失均能显著增加高钾刺激后灌流液中牛磺酸的水平。 结论：AQP4调节小鼠纹状体内高钾刺激时神经递质的释放。AOP4基因缺失能增强氨基酸类神经递质释放对高钾的反应性，而降低单胺类神经递质释放对高钾的反应性。 第二部分 AQP4基因缺失对CD1小鼠MPTP神经毒性的影响 目的：研究、阐明AOP4对小鼠MPTP神经毒性的调节及其作用机制。 方法：1)应用经典化学毒素MPTP腹腔注射(一天四次，每次20 mg·kg<'-1>，间隔2h，总量为80 mg·kg<'-1>)制备帕金森病小鼠模型，应用自主行为和爬竿实验观察行为学改变，应用免疫组织化学研究多巴胺能神经元损伤、星形胶质细胞活化情况，应用高效液相色谱法检测纹状体多巴胺及其代谢产物的含量改变，应用ELISA法检测纹状体胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophicfactor，GDNF)释放水平，应用Realtime-PCR法检测纹状体和中脑白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)和睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophic factor，CNTF)mRNA的水平；2)原代培养小鼠星形胶质细胞，MPP<'+>制备细胞毒性模型，应用MTT和[<'3>H]-TdR渗入法分别观察AOP4缺失对星形胶质细胞活力和增殖的影响。 结果：1)在帕金森病小鼠模型中，MPTP能显著下调野生型小鼠黑质和纹状体内AQP4 tuRNA和蛋白的表达水平，而且AQP4基因缺失能显著增加CD1小鼠对MPTP神经毒性的敏感性：给予MPTP后，野生型和基因敲除小鼠的死亡率分别为20％和40％，基因敲除小鼠的死亡率为野生型的2倍，其体重显著下降，运动障碍更为严重，黑质致密部多巴胺能神经元死亡程度加剧，纹状体多巴胺含量也显著低于野生型。2)对星形胶质细胞形态及功能的研究表明：AQP4基因敲除导致基础状态下黑质区域星形胶质细胞的活化增殖，显著抑制MPTP诱导的中脑和纹状体星形胶质细胞增生，纹状体内GDNF释放水平的显著降低，对GSH含量则无显著影响。3)Realtime-PCR的实验结果表明：AQP4基因敲除后，中脑IL-6 mRNA基础水平显著降低，纹状体IL-6 mRNA和这两个脑区的CNTF mRNA水平则无显著改变；给予MPTP后，野生型小鼠纹状体IL-6和CNTF mRNA水平显著增加，同时中脑IL-6和CNTF mRNA水平显著降低，但基因敲除小鼠这两个脑区的IL-6 mRNA较基础水平均未出现显著改变，CNTF mRNA的改变则与野生型小鼠一致。4)在原代培养的星形胶质细胞上进一步证实，AQP4基因缺失能显著增加MPP<'+>对星形胶质细胞的毒性作用，其细胞活力、增殖均较野生型降低。 结论：AOP4基因缺失导致CD1小鼠中脑IL-6 tuRNA水平的降低，并抑制MPTP诱导后IL-6 tuRNA水平的改变，减少星形胶质细胞活化增殖和GDNF的释放，增加小鼠对MPTP神经毒性的敏感性，表明AOP4与PD发生、发展相关，其机制在于对星形胶质细胞功能的调节。 综上所述，本研究工作的主要创新之处在于： 1．首先发现表达于星形胶质细胞上的AQP4参与中枢神经传导的调节，开拓了AQP4神经生物学研究的新领域，为进一步研究脑内AOP4的生理病理功能积累了学术基础。 2．应用AQP4基因敲除鼠，从整体、细胞和分子水平系统研究、阐明AQP4与PD发生发展的相关性，并明确其机制在于对星形胶质细胞功能的调节。 3．揭示AOP4是星形胶质细胞功能调节的重要靶点，为PD等神经退行性疾病的临床治疗提供了新的思路，为研发理想的神经保护剂提供了新的靶标。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一部分AQP4基因缺失对小鼠中枢神经传导的影响

一、AQP4基因缺失对小鼠基础状态下脑内神经递质水平的影响

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

二、AQP4基因缺失对高钾刺激的小鼠纹状体神经递质释放的影响

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

第二部分AQP4基因缺失对CD1小鼠MPTP神经毒性的影响

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

结 语

参考文献

附录

综述:水通道的细胞功能

致 谢