基于RNA-Seq技术的胶质类芽孢杆菌KNP414转录组学研究

摘要

胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）具有释放营养离子和固氮等功能，在钾、磷和其他土壤元素的生物地球化学循环中起着不可或缺的作用。这些功能使其可以作为生物肥料、生物络合剂、生物絮凝剂而广泛应用于农业、生物冶金和废水处理等领域，但这些功能的分子基础及作用机制尤为未知。转录组学研究有助于了解特定生命过程中相关基因的整体表达情况，进而从转录水平初步揭示该生命过程的代谢网络及其调控机理。RNA-Seq技术的发展和成熟，为转录组学的研究提供了高效和准确的手段，本论文采用该技术对P.mucilaginosus KNP414菌株进行了有氮和无氮培养条件下不同时期的转录组测序，以为胶质类芽孢杆菌氮代谢途径及其调控研究提供参考。
　　分别选取无氮和有氮条件培养11h和18h的细胞作为对数期和稳定期的样品进行RNA提取、文库构建和转录组测序，数据分析以18h的两个样品为主。对18h两个样品——无氮培养稳定期（18hN-）和有氮培养稳定期(18hN+)的转录组数据大小分别为1.77G和3.48G，从原始总reads中去掉接头和reads mean quality小于20（低质量）的reads后，分别获得有效的reads数各为17，298，505和34，275，841。将这些有效的reads分别与基因组匹配，并计算每个样品各个基因的标准表达量（FPKM值）。根据P.mucilaginosus KNP414基因组所预测的7811个编码基因，这两个样品的转录组中检测到的表达基因数分别为7457和7765个。差异表达基因分析结果发现:18hN-相对于18hN+显著上调和下调表达的基因数分别为895个和4596个。
　　利用Blast2GO软件对以上差异表达基因进行GO功能富集分析。结果，显著上调和下调的GO team分别为42个和80个。采用KOBAS网站上提供的超几何检验的统计学方法以基因组为背景进行差异表达基因的pathway富集分析，发现显著上调和下调的pathway分别均为3个。这些富集结果可以初步解释引起胶质类芽孢杆菌KNP414在不同生长条件下产生不同表型特征的原因。
　　以氮代谢途径、氨基酸代谢途径、蛋白质代谢途径、芽孢萌发过程、转运、信号转导这几个途径为代表，深入分析了18hN-和18hN+这两个样品转录组的特征。18hN-样品与氮代谢相关的32个基因中有10个是上调表达的，这些基因可能与固氮作用相关;此外，还有荚膜多糖和较多孢子萌发过程相关基因的表达在是上调表达的，这与表型特征相符。有氮培养条件下稳定期(18hN+)的转录组变化情况较复杂，除了稳定期特有的基因表达变化外，应激氮缺乏的基因也可能发生上调表达。18hN+样品有75.62％(152/201)的氨基酸代谢相关的基因是上调表达的;同时大量与蛋白质代谢相关基因发生了上调表达，包括RNA聚合酶合成、氨酰基-tRNA合成、核糖体、缩氨酸合成、蛋白质转运、蛋白质分解代谢、蛋白质折叠和修饰过程相关基因;另外，ABC转运系统、双组份系统和磷酸化的信号转导系统相关基因在18hN+中也有显著上调表达。
　　综上，本研究利用RNA-Seq技术解析了胶质类芽孢杆菌KNP414在有氮和无氮培养条件下稳定期的转录组特征，为该菌氮代谢途径及其调控研究提供了参考数据;但在转录组分析中未发现已知固氮基因的表达差异变化，因此该菌固氮机制还有待深入研究。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．转录组学

1．1 转录组学概述

1．2 转录组学研究的方法

1．3 转录组学研究的现状和内容

2 芽孢杆菌属微生物转录组学研究现状

3 类芽孢杆菌属微生物研究现状

4 胶质类芽孢杆菌研究进展

4．1 胶质类芽孢杆菌的分类地位

4．2 胶质类芽孢杆菌的特性

4．3 胶质类芽孢杆菌的功能及相应机理研究进展

4．4 胶质类芽孢杆菌分子水平上相关领域的研究进展

5 课题的立题依据及意义

第二章 转录组样品的制备及RNA-Seq测序

1 实验材料

1．1 菌种

1．2 主要试剂

1．3 主要试剂和培养基的配制

1．4 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 测序用的菌体的准备

2．2 总RNA的制备与质量检验

2．3 cDNA文库的构建

2．4 cDNA文库测序

3 结果与分析

3．1 胶质类芽孢杆菌KNP414总RNA的提取

3．2 核糖体RNA的扣除

3．3 RNA-Seq文库制备

3．4 测序

4 小结与讨论

第三章 原始数据的处理

1 数据分析方法

1．1 原始数据的过滤

1．2 与基因组匹配

1．3 基因表达水平的标准化

1．4 计算差异表达基因

2 结果与分析

2．1 数据过滤结果

2．2 与基因组匹配的结果

2．3 基因表达水平的标准化

2．4 差异基因计算结果

3 小结与讨论

第四章 差异表达基因的分析

1 数据分析方法

1．1 差异表达基因的GO功能富集分析

1．2 差异表达基因的pathway富集分析

2 结果与分析

2．1 GO功能富集分析

2．2 pathway富集分析

2．3 无氮和有氮生长条件下稳定期样品的转录组特征

3 小结与讨论

第五章 总结与展望

1 论文总结

2 展望

附录一 主要生化试剂表

附录二 培养基的配制

附录三 重要试剂的配制

参考文献

致谢