胶质类芽孢杆菌KNP414抗逆比较基因组及氮饥饿的转录组分析

摘要

胶质类芽孢杆菌广泛分布于土壤中，尤其在贫瘠土壤中分布较多。该菌可分解不溶性矿物，释放钾、磷等土壤元素，并具有絮凝、固氮等功能，使其广泛利用于农业生产、污水处理等领域。研究该菌适应贫瘠、废水等胁迫环境的机制对进一步拓展的应用领域具有现实意义。本论文通过比较基因组学及氮饥饿条件下的转录组分析对KNP414菌株抗逆性相关基因进行初步研究，以阐明KNP414菌株在氮营养匮乏条件下的应激反应及其适应机制。
　　首先，将KNP414菌株的基因组与另外4株类芽孢杆菌（Paenibacillussp.Y412MC10、Paenibacillussp.JDR-2、PaenibacilluspolymyxaE681、PaenibacilluspolymyxaSC2）的基因组进行比较分析，发现该菌的基因组具有胞外多糖合成、芽孢形成、氮代谢应激等多种抗逆性相关基因。
　　胞外多糖合成相关基因的比较基因组分析表明:菌株KNP414的基因组中存在胞外多糖合成所需的成套基因:单糖合成及其活化、糖基转移酶和多糖转运蛋白基因等。这些基因所涉及的单糖包括甘露糖、半乳糖、鼠李糖、果糖;活化的核苷酸单糖包括GDP-α-D-甘露糖、GDP-β-L-半乳糖、dTDP-L-鼠李糖、ADP-葡萄糖、dTDP-D-葡萄糖、GDP-果糖;编码糖基转移酶的基因有44个，这些基因大部分处于3个基因簇中，其中基因簇(Ⅰ)所含基因最多，包括10个编码糖基转移酶的基因、4个胞外多糖合成相关基因和5个编码核苷酸糖合成酶的基因;编码多糖转运蛋白的基因有178个，这些转运蛋白参与麦芽糖、麦芽三糖、半乳糖寡糖、棉子糖、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖、甲基葡萄糖醛低聚木糖等寡糖的转运。另外，KNP414菌株的基因组缺乏葡萄糖-6-磷酸酶和木糖合成基因，但存在甲基葡萄糖醛低聚木糖转运和水解蛋白基因簇，这些基因可能为多糖合成过中木糖单元的供应提供条件。
　　芽孢是芽孢杆菌适应逆境胁迫的常用方式。比较基因组分析表明，KNP414菌株的基因组中拥有典型的芽孢形成调控与结构基因，其中5个主要的调控基因为spo0A、sigE、sigF、sigK、sigG。
　　氮代谢应激相关基因的比较基因组分析结果表明:KNP414菌株拥有两条氨同化途径，一条为谷氨酰胺合酶途径，该途径将氨同化为谷氨酰胺;另一条为谷氨酸脱氢酶途径，该途径将氨同化为谷氨酸。与其它4个类芽孢杆菌菌株相比，KNP414菌株拥有两个独特的氨基酸代谢途径:其一为组氨酸降解途径，将组氨酸降解为谷氨酸;其二为天冬酰胺合成途径，将天冬氨酸转化为天冬酰胺。另外，在KNP414菌株的基因组内没有发现典型的固氮酶基因，但发现与固氮相关的基因nifU，该基因位于一个Fe-S簇转移相关的基因簇中。
　　其次，研究了KNP414菌株在氮饥饿状态下的表型及转录组学分析。表型分析表明，氮饥饿条件下，KNP414菌株在培养3h后即开始形成荚膜，11h后即形成芽孢并且荚膜形成相对稳定，并有较多的芽孢形成，为此进一步分析11h的转录组。转录组分析结果表明，KNP414菌株的基因组中有多个与多糖合成、芽孢形成、氮代谢应激相关基因的表达量发生显著变化。对19个显著变化的基因进行荧光定量PCR验证，结果表明转录组数据准确可靠。
　　多糖合成相关基因的表达:氮饥饿条件下，果糖-6-磷酸合成相关基因的表达显著上调，果糖-6-磷酸可转化为多种核苷酸单糖;但其它单糖合成相关基因的表达未见显著提高。同时，多种核苷酸糖合成相关基因的表达显著上调，包括dTDP-L-鼠李糖、ADP-葡萄糖、dTDP-D-葡萄糖、GDP-β-L-半乳糖、GDP-α-D-甘露糖等。另外，糖基转移酶基因簇(Ⅰ)中大部分基因显著上调，该基因簇主要编码多糖转运蛋白基因和核苷酸糖合成酶基因。
　　芽孢形成相关基因的表达:氮饥饿条件下，与芽孢合成相关的调控基因显著上调表达，这些基因编码控蛋白Spo0A、δE、δF、δK、δG，进而调控大量芽孢结构基因的表达，最终形成芽孢。
　　氮代谢应激相关基因的表达:氮饥饿条件下，多肽ABC转运系统相关基因、尿素分解代谢途径相关基因（ureABC）、组氨酸分解代谢途径相关基因（hut）及精氨酸分解代谢途径相关基因（rocABCDEF）显著上调表达;另外，发现11个氨同化相关基因的表达量显著上调，其中基因glnA2的表达量下调了2.7倍，基因rocG、rocG3也显著上调表达，表明氮饥饿条件下KNP414菌株大量分解多种氨基酸，并通过氨同化——主要是氨酸脱氢酶途径将分解的氨基酸转化为谷氨酸储存起来。谷氨酸在氮代谢中占据着轴心的位置，可作为细胞内大约85％氮化合物的供体，KNP414菌株通过这些途径实现氮饥饿条件下氮营养的高度节约化利用。
　　综上所述，KNP414菌株在氮饥饿条件下，可通过胞外多糖合成、芽孢形成、氮代谢调整等多种方式实现应激性保护反应，从而适应氮饥饿等多种胁迫环境。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 多糖研究进展

1．1 胞外多糖的概述

1．2 胞外多糖的组成

1．3 胞外多糖的功能

1．4 细菌多糖合成的研究进展

1．5 细菌胞外多糖基因簇的研究

2 芽孢形成的研究进展

2．1 芽孢形成的不同阶段

2．2 芽孢的结构

2．3 芽孢形成的相关基因

3 氮应激反应

3．1 节约化利用氮源

3．2 固氮

4 胶质类芽孢杆菌的研究进展

4．1 类芽孢杆菌属的研究进展

4．2 胶质类芽孢杆菌

4．3 胶质类芽孢杆菌胞外多糖的研究进展

5．课题的立题依据及意义

第二章 比较基因组学分析

1 实验材料

1．1 菌株基因组数据

1．2 分析软件

2 比较基因组的分析方法

2．1 Blast本地化构建

2．2 代谢途径分析

3 结果与分析

3．1 胞外多糖合成相关基因的分析

3．2 芽孢形成相关基因分析

3．3 氮应激相关基因的分析

4 小结与讨论

第三章 氮饥饿条件下的转录组分析

1 实验材料

1．1 转录组数据

1．2 菌株

1．3 培养基的配置

1．4 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 表型分析

2．2 转录组分析

2．3 转录组数据可靠性的荧光定量PCR验证

3 结果与分析

3．1 氮饥饿条件下的表型分析

3．2 氮饥饿条件下的转录组分析

3．3 荧光定量PCR对转录组数据的可靠性验证

4 小结与分析

总结

参考文献

致谢