群体感应AHLs信号分子对鱼源杀鲑气单胞菌致腐及抗胁迫能力的影响

摘要

群体感应(quorum sensing，QS)参与调控食源性微生物的致病性和致腐性。气单胞菌为气单胞菌属(Aeromonas)的革兰氏阴性直杆菌，是水产养殖业重要的条件致病菌和生鲜鱼类贮藏中的腐败菌。前期研究已从腐败大黄鱼中分离出致腐性强的杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)，发现A.salmonicida能够诱导群体感应生物报告菌产生颜色，提示该细菌具有N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone，AHLs)活性。然而，鱼源致腐菌A.salmonicida产生的AHLs与致腐内在调控作用研究仍较少。鉴于此，本论文以A.salmonicida AE03为研究对象，分析在不同培养条件下AHLs的形成规律和种类;扩增并分析编码AHLs的基因asaI，构建asaI基因突变株;比较研究野生株、asaI突变株和C4-HSL回补株在生长、腐败表型、运动性、生物被膜形成和抗胁迫性的影响。进一步采用qRT-PCR技术探究asaI缺失对致腐和抗胁迫性相关基因表达的影响。研究旨在揭示AHLs介导的QS对A.salmonicida致腐和抗胁迫能力的调控作用，为食品腐败菌机理和控制研究提供理论支持。主要结果如下:
　　利用生物报菌紫色杆菌(Chromobacterium violaceum) CV026检测了A.salmonicida AE03不同培养条件下AHLs的形成规律。结果发现4℃和28℃下培养的AE03均能使CV026产生紫色反应，其中在4℃培养5d和28℃培养30h的上清诱导产生的紫色圈最大，呈现密度依赖性。随着培养基中氯化钠浓度增高，AE03产生的AHLs活性逐步增强，其中1.5％氯化钠紫色圈最大，之后紫色圈减少。采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)检测培养上清中AHLs种类和含量，显示AE03能够产生C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL五种信号分子，其中C4-HSL含量最高，并且28℃培养30h达到最高，与报告菌结果一致。AE03上清在弱酸或强碱处理下AHLs活性明显下降，其中pH7.8时AHLs活性保持最高。高温加热能降解菌体上清中AHLs信号分子，随着加热时间的延长，CV026变色圈直径迅速减少，AHLs活性逐渐丧失。
　　采用PCR在A.salmonicida AE03中扩增出asaI基因，通过融合PCR和自杀性质粒，构建A.salmonicida AE03 asaI基因突变株。AHLs活性检测显示，突变株asaI丧失诱导报告菌CV026产生紫色，HPLC-MS/MS也发现AHLs含量很低，未检测到C4-HSL和C6-HSL信号分子。
　　比较研究野生株、asaI突变株及C4-HSL回补株在体外培养和鱼汁中的腐败表型、生物被膜、抗胁迫性和致腐能力的差异。研究显示，AE03野生株、asaI突变株和C4-HSL回补株在28℃下生长无显著差异。相比于野生株，asaI突变株在12h、18h和24 h后三甲胺(TMA)分别增加100.2％、22.3％和24.9％，而添加C4-HSL回补株TMA有所下降，特别是添加40μM C4-HSL时TMA分别下降52.7％、28.5％和27％。相似地，asaI突变株在培养12h、18h、24 h形成的生物胺比野生株分别增加21.5％、22.4％和23.2％(p＜0.05)，而20μM C4-HSL回补株分别下降16.3％、7.2％和6.5％(p＜0.05），40μM C4-HSL处理组则减少28.6％，14.5％和16.4％(p＜0.05)。突变株胞外蛋白酶的活性也显著提高(p＜0.05），外源添加C4-HSL导致突变株分泌胞外蛋白酶活性下降，与野生株的蛋白酶活性接近。可见与野生株相比，asaI突变株腐败表型都显著增强，并且外源C4-HSL添加浓度越高，致腐产物形成降低，表现浓度依赖性。结晶紫染色法发现A.salmonicida AE03生物被膜形成速度较快，其中培养12h被膜产量达到最大值，而asaI突变株比野生株的被膜量减少32.1％，共聚焦显微镜观察也显示AE03成熟的生物被膜厚度为52.52μm，而asaI突变株仅为36.66μm。野生株和突变株的抗胁迫性比较研究发现，在50℃热处理后菌体的存活率逐渐减少，其中60 min后野生株和突变株存活率分别下降为46.8％和54.1％(p＜0.05);2mM双氧水处理导致野生株存活率急剧下降，而asaI突变株减少较为缓慢，经5 min处理后两菌株的存活率分别为70.3％和87.1％(p＜0.05);30％氯化钠处理90 min时，野生株和突变株存活率分别为50.5％和59.8％(p＜0.05)。结果发现，asaI突变株能够增强菌体对高温、双氧水和高盐的抗胁迫能力。因此，A.salmonicida AE03中asaI基因突变促进TMA和生物胺的形成，增加胞外蛋白酶活性和泳动性，而减弱生物被膜形成;外源C4-HSL添加能部分恢复致腐表型，表现浓度依赖性;asaI基因突变还能增强对环境抗胁迫性。
　　进一步评价AE03野生株、asaI突变株和C4-HSL回补株在4℃冷藏灭菌鱼汁中致腐能力的变化。结果显示，AE03野生株、asaI突变株和C4-HSL回补株在鱼汁样品中生长无显著差异，在4℃第3d达到早期稳定期。AE03在冷藏最初2d蛋白酶活性、TMA和挥发性盐基氮(TVB-N)增长缓慢，而第3d其含量迅速增长，第5d达到最高值。AE03野生株、asaI突变株、20μM C4-HSL和40μM C4-HSL回补株第5d时的蛋白酶活性分别为5.92、8.16、6.64和5.88活力单位;TMA含量分别为22.81、33.18、30.19和26.70 mg/100mL; TVB-N含量分别为22.75、27.30、24.85和22.62 mgN/mL。相对于AE03野生株，asaI突变株在冷藏鱼汁中的蛋白酶活性、TMA和TVB-N含量明显增强，而突变株中添加C4-HSL减少腐败能力。结果表明，asaI基因突变促进AE03在冷藏鱼汁腐败酶和代谢产物的产生，加速腐败进程。而外源添加C4-HSL降低了asaI突变株腐败能力，进一步提示asaI基因及AHLs参与调控AE03的致腐能力。
　　为探究asaI基因对AE03致腐酶、鞭毛和抗性基因表达的影响，采用qRT-PCR检测氧化三甲胺还原酶(TMAO reductase)基因torA、编码赖氨酸脱羧酶基因cadA、鞭毛相关基因fliR、过氧化氢酶基因katG和AHLs感受蛋白基因asaR在不同生长阶段的转录水平。结果发现，野生株、突变株和C4-HSL回补组之间在对数生长期(12 h)、稳定初期(18h)和稳定期(24 h)三个阶段5个基因的相对表达量都存在显著差异。突变株的torA、cadA、fliR和katG在18h时的表达量与野生株差异最大，分别增加了2.29、2.29、1.69和9.86倍。而突变株asaR基因相对表达量在12h与野生株差异最大，为野生株的2.65倍。突变株在培养24 h五个基因的表达量都逐渐下降，仅torA和katG基因表达量大于野生株(P＜0.01)。同时，asaI突变株中20μM和40μMC4-HSL的回补株，5个基因的相对表达量都显著下降，并逐渐恢复至野生株水平，尤其是40μM C4-HSL添加组。
　　可见，A.salmonicida在4℃和28℃都能分泌AHLs信号分子，该分子参与调控A.salmonicida致腐和抗胁迫作用，其中C4-HSL正调控该菌的生物被膜形成，而负调控致腐和抗胁迫相关基因表达，进而影响致腐及抗胁迫能力。

目录

摘要

1．1．1 群体感应的定义

1．1．2 群体感应与食品腐败

1．1．3 群体感应与抗胁迫性

1．2 气单胞菌

1．2．1 气单胞菌中的群体感应

1．2．2 气单胞菌中群体感应和生物被膜间的关系

1．2．3 气单胞菌群体感应与致腐性的关系

1．3 本课题的研究目的、意义和内容

第二章 鱼源杀鲑气单胞菌AHLs信号分子活性分析

2．1 前言

2．2 材料与设备

2．2．1 菌株及培养条件

2．2．2 试剂和培养基

2．2．3 主要设备

2．3 实验方法

2．3．1 杀鲑气单胞菌的生长曲线

2．3．2 生物报告菌检测杀鲑气单胞菌AHLs信号分子

2．3．3 杀鲑气单胞菌AHLs信号分子的提取

2．3．5 高温和pH对AHLs信号分子活性的影响

2．3．6 数据处理和分析

2．4 结果与分析

2．4．2 菌株AE03在不同氯化钠浓度下的生长和AHLs活性

2．4．3 LC-MS／MS检测AE03AHLs信号分子

2．4．4 环境因素对AE03菌株AHLs活性的影响

2．5 讨论

第三章 杀鲑气单胞菌AHLs合成基因asaI的分析及突变株构建

3．1 前言

3．2 材料与设备

3．2．1 细菌及培养条件

3．2．2 培养基和主要试剂

3．2．3 仪器设备

3．3 实验方法

3．3．1 菌株AE03的asaI基因PCR扩增

3．3．2 菌株AE03的asaI基因序列分析

3．3．3 菌株AE03 asal基因突变株的构建

3．3．5 报告菌法和LC-MS／MS检测asaI突变株AHLs活性

3．4 结果与分析

3．4．1 菌株AE03中asaI基因扩增

3．4．2 菌株AE03中asaI基因序列分析

3．4．3 菌株AE03 asaI基因突变株的构建

3．4．4 菌株AE03 asaI突变株的AHLs活性分析

3．5 讨论

第四章 杀鲑气单胞菌asaI突变株对致腐和抗胁迫性的影响

4．1 引言

4．2 材料与仪器

4．2．1 原料

4．2．2 细菌及培养条件

4．2．3 主要试剂

4．2．4 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．3 TMA的测定

4．3．4 生物胺含量测定

4．3．5 胞外蛋白酶含量的测定

4．3．6 结晶紫法测定生物被膜

4．3．7 共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察生物被膜

4．3．8 泳动能力的测定

4．3．9 高温、氯化钠和H2O2的抗胁迫性检测

4．3．10 灭菌鱼汁中腐败能力的验证

4．3．11 荧光定量PCR检测

4．3．1 2数据处理和制图

4．4 结果与分析

4．4．1 AE03野生株和asaI突变株的生长曲线

4．4．2 AE03野生株、asal突变株和C4-HSL回补株的致腐表型

4．4．3 AE03野生株与asal突变株的生物被膜形成

4．4．4 AE03野生株与asaI突变株的泳动性

4．4．5 AE03野生株与asaI突变株的抗胁迫性分析

4．4．6 AE03野生株、asaI突变株和C4-HSL添加株在鱼汁中腐败能力的评价

4．4．7 RT-PCR检测torA、cadA、fliR、katG和asaR基因的表达量

4．5 讨论

5．1 总结

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

致谢

硕士期间完成的论文

声明

附录