利用酵母细胞生物转化法合成天然2-苯乙醇的研究

摘要

2-苯乙醇是一种具玫瑰气味的芳香醇，作为香料广泛用于食品、日化和轻工等领域。人们对天然香料消费需求的日益增长，推动了利用生物技术方法生产天然2。苯乙醇的研究。以发酵法或酶法生产的L-苯丙氨酸为前体，利用酵母细胞将其转化为2-苯乙醇，产品具有天然属性，可以取代从玫瑰或其它植物精油中提取的天然2。苯乙醇，具有广阔的开发前景。本文以提高2-苯乙醇转化浓度和生产率为目标，从上、中、下游系统地研究了2-苯乙醇转化合成工艺，大幅度提高了2-苯乙醇的转化浓度和生产率，为生物转化法合成天然2-苯乙醇的工业化应用奠定了良好的基础。
　　 从15个酵母菌株中，筛选出1株对2-苯乙醇耐受性强、转化合成2-苯乙醇浓度高的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BD菌株，对其进行纯化并结合紫外诱变，得到酿酒酵母BD18菌株，在未经优化的培养基中，该菌株转化合成2-苯乙醇浓度达到2.04 g/L，是1株适用于2-苯乙醇的生物转化合成的理想菌种。
　　 采用单因素试验和正交试验，优化了转化合成2-苯乙醇的培养基组成、种子培养基组成和转化培养条件，使得2-苯乙醇浓度有大幅度提高。摇瓶转化合成2-苯乙醇的最佳工艺是：种子培养基组成为葡萄糖40 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸出粉10g/L，装量为40 mL/250mL三角瓶；转化培养基组成为蔗糖120 g/L、酵母浸出粉5g/L、KH2PO47.5 g/L、K2HPO49.6 g/L、MgSO4·7H2O0.5 g/L，装量为30 mL/250mL三角瓶；种子培养基接种后于30℃培养24 h，按10％的接种量移种至转化培养基，再加入10 g/L的L-苯丙氨酸；转化体系于30℃、200 r/min条件下培养18 h，2-苯乙醇的浓度可达到4.64 g/L，摩尔产率为62.7％，生产率为0.26 g/(L·h)。
　　 采用Box-Behnken中心组合设计和响应面分析，建立了2-苯乙醇浓度与蔗糖、酵母浸出粉和L-苯丙氨酸之间的二次多项式回9j模型，模型具有较高的准确性和实用性，可为生物转化法合成2-苯乙醇的最优化生产提供理论基础。
　　 采用油酸萃取，聚丙二醇2000萃取和D101大孔树脂吸附3种产物原位分离法转化合成2-苯乙醇，2-苯乙醇的摩尔产率均有所提高。在油酸与培养基体积比为1:3，振荡转速为250 r/min，转化温度为30℃，底物浓度为14 g/L的条件下，转化培养18 h，油酸和水相中2-苯乙醇的浓度分别达到14.9 g/L和1.74 g/L，2-苯乙醇的摩尔产率达到64.7％，生产率达到0.37 g/(L·h)，较单一水相体系生物转化合成2。苯乙醇的生产率0.26 g/(L·h)提高了44.3％。以聚丙二醇2000为萃取溶剂，加入体积与培养基体积比为1:2，底物浓度为12 g/L时，转化18 h，聚丙二醇中的2-苯乙醇浓度可达11.1 g/L，摩尔产率为68.1％，生产率为0.31 g/(L·h)。在30 mL培养基中加入2g湿大孔树脂D101，底物浓度为12 g/L，转化24 h，2-苯乙醇总浓度可达6.17 g/L，其中3.15 g/L保留在培养基中，3.02 g/L吸附到D101中，摩尔产率达到69.5％，生产率为0.26 g/(L·h)。
　　 在SL发酵罐中，进行常规水相体系、有机溶剂萃取法和大孔树脂吸附法转化合成2-苯乙醇的放大实验，取得的结果与摇瓶工艺相近，表明摇瓶转化工艺放大较为容易。基于SL发酵罐生物转化合成2-苯乙醇得到的菌体得率、2-苯乙醇浓度、蔗糖消耗实验数据，建立了转化过程中菌体生长的Logistic模型、2-苯乙醇生成的Luedeking-Piret模型和蔗糖消耗的Luedeking-Piret相似模型。3个动力学模型具有较高的拟合精度，能准确反映2-苯乙醇生物转化过程及其动力学特征，可用于酿酒酵母转化生产2-苯乙醇过程的预测。
　　 通过对多种有机溶剂的筛选，得出乙酸乙酯是萃取分离2-苯乙醇的最佳溶剂，其萃取的最佳相比0.5，萃取液经减压蒸馏除去乙酸乙酯，便得到提纯的2-苯乙醇，收率为93.6％，纯度可以达到90.7％。静态吸附实验结果表明大孔树脂D101也是很好的2-苯乙醇分离吸附剂。采用大孔树脂D101柱分离2.苯乙醇中，当转化液中2-苯乙醇浓度为4.5 g/L左右时，最佳上样量为5.5柱体积(BV)，上样速度10 BV/h。样品上柱后，用上样量同等体积的蒸馏水洗涤树脂，再用3 BV的95％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏去除乙醇，此工艺条件下分离得到的2-苯乙醇样品收率为84.4％，纯度为85.2％。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1文献综述

1.1微生物转化

1.1.1概述

1.1.2微生物转化的特点

1.1.3微生物转化的方法

1.2生物转化与香料香精

1.2.1香料香精概述

1.2.2生物转化与天然香料香精

1.3 2-苯乙醇概述

1.3.1 2-苯乙醇的理化特征

1.3.2化学法合成2-苯乙醇

1.3.3 2-苯乙醇的纯化

1.4生物转化法合成2-苯乙醇

1.4.1生物转化法合成2-苯乙醇的代谢途径

1.4.2生物转化法合成2-苯乙醇的微生物

1.4.3 2-苯乙醇对细胞的毒性

1.5本论文研究的意义、目的与内容

2生物转化法合成2-苯乙醇的菌株筛选

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1主要实验试剂

2.2.2酵母菌株

2.2.3培养基

2.2.4 2-苯乙醇的转化合成

2.2.5酵母菌株对2-苯乙醇的耐受性比较试验

2.2.6酵母菌株的紫外诱变与分离

2.2.7 2-苯乙醇浓度的测定

2.2.8 2-苯乙醇气相色谱-质谱联用鉴定

2.2.9酵母细胞生物量的测定

2.2.10 2-苯乙醇的摩尔产率计算

2.2.11数据处理

2.3结果与分析

2.3.1菌株初筛

2.3.2菌株复筛

2.3.3酵母菌株对2-苯乙醇的耐受性比较

2.3.4酿酒酵母BD菌株的诱变与分离

2.4本章小结

3生物转化法合成2-苯乙醇的工艺研究

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1转化菌种

3.2.2培养基

3.2.3 2-苯乙醇转化合成

3.2.4 2-苯乙醇浓度的测定

3.2.5 L-苯丙氨酸浓度的测定

3.2.6酵母细胞生物量的测定

3.2.7残糖浓度的测定

3.2.8响应面试验设计和分析

3.2.9数据处理

3.3结果与分析

3.3.1转化培养基组成的优化

3.3.2种子培养基优化

3.3.3培养条件对转化合成2-苯乙醇的影响

3.3.4培养基主要组分浓度的响应面法优化

3.3.5摇瓶转化合成2-苯乙醇的时间曲线

3.4本章小结

4原位产物分离法生物转化合成2-苯乙醇的工艺研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1转化菌种

4.2.2培养基

4.2.3大孔树脂及其预处理

4.2.4大孔树脂吸附容量、解吸率和吸附率的测定

4.2.5 2-苯乙醇的生物转化合成

4.2.6 2-苯乙醇和L-苯丙氨酸浓度的测定

4.2.7酵母菌体得率的测定

4.2.8残糖浓度的测定

4.3结果与分析

4.3.1构建有机溶剂萃取转化体系的溶剂选择

4.3.2油酸萃取ISPR法生物转化合成2-苯乙醇

4.3.3聚丙二醇萃取ISPR法生物转化合成2-苯乙醇

4.3.4大孔树脂吸附ISPR法生物转化合成2-苯乙醇研究

4.4本章小结

5生物转化法合成2-苯乙醇的发酵罐小试及转化动力学研究

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1转化菌种

5.2.2发酵罐

5.2.3培养基

5.2.4 5L发酵罐中生物转化法合成2-苯乙醇实验

5.2.5分析方法

5.2.6数据处理

5.3结果与分析

5.3.1 5L发酵罐中生物转化法合成2-苯乙醇结果

5.3.2生物转化法合成2-苯乙醇动力学研究

5.4本章小结

6生物转化法合成2-苯乙醇的分离与纯化

6.1引言

6.2材料与方法

6.2.1有机溶剂和大孔树脂

6.2.2供试转化液

6.2.3有机溶剂萃取法分离2-苯乙醇

6.2.4大孔树脂静态吸附2-苯乙醇实验

6.2.5大孔树脂对2-苯乙醇的动态吸附实验

6.2.6分析方法

6.3结果与分析

6.3.1有机溶剂萃取法分离2-苯乙醇

6.3.2大孔树脂吸附法分离2-苯乙醇

6.4本章小结

7论文总结

7.1论文的研究总结

7.2论文的创新之处

7.3进一步研究的展望

参考文献

附录 酿酒酵母BD菌株转化合成2-苯乙醇样品的气质联用(GC-MS)谱图

攻读学位期间发表的论文和完成的工作