表达苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株的构建及其对斜纹夜蛾幼虫的肠道与体壁侵染力

摘要

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)为典型的昆虫病原真菌，一般经昆虫体壁附着和穿透而侵染致死寄主，由于侵染潜伏期较长而对咀嚼式口器的暴食性害虫控制效果较差。菌株毒力改良往往基于内源体壁降解酶或外源毒素基因的导入，但少见利用昆虫肠道毒力因子改造菌株的成功报道。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)可分泌产生若干高效的营养生长期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins) Vip3A，对咀嚼式鳞翅目害虫表现很高的肠道毒力，但其很低的分泌量和非晶体结构的不稳定性，使其除了转基因抗虫植物的利用途径之外迄今未见可制剂化的利用途径。利用极易生产和剂型化的生防真菌分生孢子作为Vip3A之类肠道毒力因子的载体，发挥真菌孢体壁侵染和摄入后肠道感染的互补优势，是害虫微生物防治的新挑战。
　　 为此，本研究以暴食性斜纹夜蛾(Spodoptera litura)为对象，从筛选具有较高毒力的球孢白僵菌菌株入手，构建高表达Vip3Aal(Vip3A毒蛋白家族成员之一)的球孢白僵菌工程菌株，设计合理的方法评价工程菌株对斜纹夜蛾幼虫的毒力，以确认其经体壁附着、口器摄入或双途径侵染的杀虫效应。主要内容和结果分述如下：
　　 球孢白僵菌对斜纹夜蛾幼虫的菌株筛选为了筛选出对斜纹夜蛾具有较高毒力的球孢白僵菌作为Vip3Aal的受体菌株，对生物学性状和抗逆性状良好的12株球孢白僵菌，采用国际标准喷塔法分别对斜纹夜蛾二龄幼虫进行lxl08个孢子/mL的高浓度体壁喷雾接种的生物测定，并以0.02％吐温80无菌水作为空白对照。接种后在25℃和12L:12D条件下饲养并逐日观察7天，试虫（每处理87-97头）的死亡率用对照死亡率(从第3天到第7天为1.11％-11.11％)进行校正。结果表明，在平均2473个/mm2的孢子附着量下，供试菌株引起的幼虫校正死亡率为33.90/0,-82.4％。除诱发死亡率过低的2株之外，其余10株供试菌高剂量接种对斜纹夜蛾二龄幼虫的致死中时LT50在3.9-5.4天不等。其中，Bb2860菌株对斜纹夜蛾二龄幼虫的侵染力最强，致死率最高，作为后续毒力改造的受体菌株．
　　 杀虫蛋白Vip3Aal在球孢白僵菌中的转化表达与活性分析用芽生孢子转化体系介导，以草丁膦抗性基因bar为筛选标记，将vip3Aal基因导入球孢白僵菌野生株Bb2860(BbW)中。通过一系列筛选鉴定，获得了一株生长和产孢性状良好且具有遗传稳定性的工程菌株BbV28。Western杂交和免疫胶体金定位分析显示，Vip3Aal蛋白在BbV28中组成型高表达且在其气生分生孢子细胞质呈均匀分布。用经浓度为5x108个孢子/rnL的BbV28分生孢子悬液或60g/mL原核表达的Vip3Aal溶液浸渍过的甘蓝叶片喂饲斜纹夜蛾四龄幼虫18h时后，幼虫出现个体缩小、麻痹等相同症状，而此时摄入相同浓度BbW分生孢子悬液或仅0.02％吐温80处理叶片的幼虫表现正常。用抗Vip3Aal兔血清多克隆抗体对取食BbV28分生孢子18和36h后的四龄幼虫的中肠内容物提取液进行Western杂交，显示出与大肠杆菌表达的Vip3Aal处理组肠液样品中相同的清晰条带，主要条带的分子量约为62kDa，与文献报道经中肠液消化后的Vip3A活性片段的分子量大小一致。与此相反，在摄入BbW处理的对照组幼虫的中肠液样品中，没有被上述多克隆抗体检测到任何信号。以上结果说明球孢白僵菌工程菌株BbV28的分生孢子在进入昆虫中肠后，可释放出其内表达的Vip3Aal并发挥其应有的肠道毒力因子作用。由此证明，球孢白僵菌分生孢子作为肠道毒力因子Vip3Aal的运送载体，通过昆虫咀嚼式口器摄入抵达中肠而发挥杀虫作用。
　　 转vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株不同侵染方式对斜纹夜蛾幼虫的毒力为合理评价转vip3Aal基因的工程菌株BbV28对乾标害虫的杀虫效力，采用全自动喷塔法，将工程菌株BbV28和野生株BbW的分生孢子分别以体壁感染（生测Ⅰ）、摄入感染(生测Ⅱ)和双途径复合感染(生测Ⅲ)的三种不同方式接种斜纹夜蛾二龄幼虫，进行平行的生物测定。每个生测包含4x106、2×107and1×108个/mL不同浓度的孢子悬液处理和仅0.02％吐温80无菌水的空白对照。由此，三种浓度的孢子悬液喷雾分别产生低、中、高三个接种剂量，分别为53-66、337-390和1242-1397个孢子/mm2。每剂量处理设3次重复，每重复接种试虫30～40头。每日更换新鲜的无菌（生测I）或带菌(生测II和Ⅲ)甘蓝叶片供试虫取食并逐日观察记录死亡率共7天，每日挑出虫尸并将保湿培养。所获数据用DPS软件进行两因素随机区组方差分析和时间-剂量-死亡率模型模拟分析。
　　 结果表明，两株菌接种后导致的幼虫死亡率都随接种剂量增加和接种后时间延长而升高。各菌株接种后第7天引起的幼虫累计死亡率在三种生测间和三个接种剂量间均差异显著。在同一接种浓度下，生测Ⅱ和Ⅲ中BbV28处理的幼虫死亡显著快于BbW的处理，而生测I中两株菌导致的幼虫死亡趋势无显著差异．空白对照组的幼虫平均死亡率在生测Ⅰ～Ⅲ中无明显差异，分别为8.1％(±4.4)，3.8％(±4.2)和6.2％(±3.3)。此外，在生测I中，两株菌经体壁接触感染的幼虫均表现出相同的典型真菌致死症状，即保湿培养3天后的虫尸体表长出茂密的菌丝并产孢。在生测II和III中，经BbW感染致死的幼虫显示出与生测I中相同的症状，而经由BbV28感染而死亡较早的幼虫则多个体萎缩变小，在相同条件下保湿培养3天后虫尸体表菌丝稀疏甚至无菌丝长出。
　　 各菌株不同接种方式的生测数据很好地拟合时间一剂量一死亡率模型，由此计算出各菌株随时间变化的致死中浓度LC50和随接种浓度变化的致死中时LT50．在主要经体壁感染的生测Ⅰ中，BbW和BbV28对斜纹夜蛾二龄幼虫的LC50值及其95％置信限随接种后天数的变化无明显差异，分别由第3天的2.6(0.8～8.5)×104和1.5（0.6～4.1）×104个孢子/mm2减少到第7天的750(571-985)和698(539～900)个孢子/mm2。而在生测II和生测Ⅲ中，BbW和BbV28孢子对幼虫的LC50值的变化趋势具有显著差异。与生测I相比，随着试虫在生测Ⅱ和生测Ⅲ中摄入BbV28孢子的机会增加，使得BbV28对试虫的LC50值比BbW在第3天分别降低定26.2和17.2倍，在第7天分别降低1.1和1.3倍。在生测I中两株菌的LT50值随接种剂量增高而下降的趋势也十分相似。例如，在1000个在孢子/mm2剂量下，BbV28和Bb2860的LT50值分别为5.56和5.61天。而在生测Ⅱ和生测Ⅲ中，BbV28随接种后时间变化的的LT50趋势显著低于BbW。BbV28在生测Ⅱ800～1500个孢子/mm2剂量范围内的LT50值比BbW缩短26.9-34.8％，而在生测Ⅲ500～1500个孢子/mm2剂量范围内的LT50值缩短23.5～35.3％。
　　 以上结果表明，工程菌株BbV28既具有与野生菌株相似的体壁侵染毒力，又表现出Vip3Aal特有的肠道毒力，双侵染途径的杀虫效果显著优于野生菌株有BbW。
　　 综上所述，本研究的主要创新成果有三．一是利用国际标准喷塔接种法成功筛选到对斜纹夜蛾幼虫具有较高毒力的Vip3Aal蛋白受体菌株球孢白僵菌Bb2860。二是首次利用芽生孢子转化体系将Bt营养其杀虫蛋白基因vip3Aal导入Bb2860中，构建和筛选出能够高效表达具有肠道杀虫活性的Vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株。三是通过不同感染途径证明工程菌株对斜纹夜蛾二龄幼虫具有体壁感染和撮入后肠道感染的双途径侵染能力，其双侵染途径的毒力比野生菌株大幅提高。这是首次将vip3A基因成功转入球孢白僵菌而实现生防真菌毒力大幅提升的研究实例，创造出在发挥白僵菌既有体壁侵染优势的同时而利用Vip3A毒蛋白的新途径，有助于推动微生物杀虫剂的技术进步．

目录

文摘

英文文摘

资助

致谢

1 丝孢类杀虫真菌的毒力及其基因工程改造的研究

1.1 丝孢类杀虫真菌的侵染过程和分子机制

1.1.1 分生孢子在寄主体表的附着和萌发

1.1.2 附着胞的形成和昆虫体壁的穿透

1.1.3 菌丝体在寄主血腔内的繁殖和抗寄主免疫作用

1.1.4 孢子进入昆虫肠道后的作用

1.2 丝孢类杀虫真菌毒力改造的基因工程研究

1.2.1 杀虫真菌的遗传转化

1.2.2 杀虫真菌毒力的遗传改造

1.2.3 菌株毒力生物测定的标准化

1.2.4 小结

1.3 苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A的研究

1.3.1 Vip3A蛋白的特性

1.3.2 Vip3A蛋白的杀虫活性

1.3.3 Vip3A蛋白的杀虫作用机理

1.3.4 Vip3A蛋白基因的应用

1.4 展望

2 球孢白僵菌对斜纹夜蛾幼虫的毒力测定及菌株筛选

2.1 材料

2.1.1 供试菌株

2.1.2 供试虫源

2.2 方法

2.2.1 气生分生孢子粉制备

2.2.2 生物测定

2.2.3 数据分析

2.3 结果与分析

2.3.1 斜纹夜蛾二龄幼虫死亡率

2.3.1 不同菌株高剂量接种对斜纹夜蛾二龄幼虫的半致死时间LT50

2.4 讨论

3 杀虫蛋白Vip3Aal在球孢白僵菌中的转化表达与活性分析

3.1 材料

3.1.1 菌株与质粒

3.1.2 试剂和材料

3.1.3 供试虫源

3.2 方法

3.2.1 转化用双元载体的构建

3.2.2 感受态球孢白僵菌芽生孢子的制备

3.2.3 芽生孢子转化

3.2.4 转化子的PCR鉴定

3.2.5 转化子的RT-PCR鉴定

3.2.6 转化子的Western杂交鉴定

3.2.7 Vip3Aal蛋白在工程菌株气生分生孢子中的表达定位

3.2.8 工程菌株孢子中Vip3Aal在斜纹夜蛾幼虫中肠液中的检测

3.3 结果与分析

3.3.1 转化用双元载体的构建

3.3.2 转化子的鉴定

3.3.3 转化子的Western杂交鉴定

3.3.4 Vip3Aal蛋白在转化子BbV28中的表达和定位

3.3.5 昆虫中肠液中Vip3Aal的检测和功能

3.4 讨论

4 高表达Vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株对斜纹夜蛾二龄幼虫不同侵染方式的毒力测定

4.1 材料与方法

4.1.1 不同浓度孢子悬液和供试虫源的准备

4.1.2 生物测定

4.1.3 数据分析

4.2 结果与分析

4.2.1 三种生测中斜纹夜蛾二龄幼虫的死亡率

4.2.2 时间-剂量-死亡率模型模拟与毒力指标的估算

4.3 讨论

5 讨论与展望

参考文献

附录：攻读博士学位期间的主要成果