耐辐射球菌中丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶家族基因的初步研究

摘要

蛋白质中丝氨酸、苏氨酸的可逆磷酸化，可以改变氨基酸的空间位阻、电荷、稳定性，控制蛋白质的活性、定位、稳定性和互作。磷酸化参与了细胞周期、细胞分化、应激反应等多个方面的调控。耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是至今发现的抗辐射能力最强的生物之一，对电离辐射、UV辐射、过氧化氢等压力具有很强的抗性。耐辐射球菌可以耐受5 kGy的电离辐射而不受影响。高效的DNA修复能力、多种抗氧化机制和快速DNA损伤响应能力，对耐辐射球菌的极端抗性做出了巨大的贡献。现有的对耐辐射球菌的研究大多数集中在前两个方面，人们对于DNA损伤响应机制了解很有限。在这个响应过程中是否有蛋白合成后修饰的调节，尚缺进一步研究。本论文通过研究磷酸化过程关键参与者蛋白激酶对磷酸化修饰在耐辐射球菌电离辐射后恢复中的作用进行了初步研究。
　　 耐辐射球菌基因组编码了二十个丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶，本文选择了十个已注释的丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶进行研究，包括DR0058、DR0534、DR1213、DR1243、 DR1851、DR2108、DR2518、DR2546、DRA0332、DRA0334。我们首先利用重组技术将抗性基因替代目标基因，进而成功构建目标基因敲除突变株。为研究这些激酶在耐辐射球菌电离辐射后恢复中的作用，我们比较这些突变株与野生株在DNA损伤因子胁迫下的生存率。结果发现，dr0058、r0534、r1213、dr1851、dr2108、dra0332和dr0334等七个基因的突变株电离辐射抗性与野生型相差不大，表明这七个基因对电离辐射抗性没有明显贡献，没有参与辐照后修复机制的调控。然而，在dr1243或dr2518被敲除后，耐辐射球菌生长速度有所减缓，表明这两个基因可能参与细胞生长的调控。另外，dr1243、dr2518、dr2546三个蛋白激酶基因的突变均导致耐辐射球菌对γ辐射、UV射和过氧化氢等DNA损伤因子敏感。其中，dr2518的缺失导致耐辐射球菌对γ辐射和UV辐射非常敏感，与已报道的结果类似。而dr1243缺失后，耐辐射球菌对γ辐射和过氧化氢的抗性在高剂量时下降10多倍，明显高于dr2546基因的缺失对耐辐射球菌抗性的影响。数据明显表明dr1243、dr2518、dr2546表达的三个激酶蛋白参与电离辐射抗性和辐照后修复机制的调控，构成了耐辐射球菌中抗性的形成部分，尤其是dr1243。
　　 基于dr1243的缺失导致耐辐射球菌对电离辐射敏感，我们进一步探讨了DR1243激酶在细胞内的调控机制。我们用提取了dr1243突变株和野生株的RNA，用基因芯片技术扫描比较了各个基因的转录水平差异。结果发现，dr1243基因的敲除导致了大量（51个）基因的转录水平下调（差异倍数大于2倍，同时在统计学上差异显著），仅有少数基因发生上调。下调基因按COG分类可以成15类，其中有5个下调基因参与无机离子转运和代谢，3个基因属于压力响应相关基因，5个基因属于氨基酸转运和代谢途径等。而且其中包括RNA连接酶DRB0094、铁离子调控蛋白Fur(DR0865)等十分有趣的基因，其可能间接的调控了RNA修复、体内Fe水平、体内自由基浓度、Mn/Fe比等影响细胞抗性的代谢因素。这些结果表明，基于dr1243信号传导系统在体内调控了多个功能途径。
　　 综上所述，dr0058、dr0534、dr1213、dr1851、dr2108、dra0332、dra0334七个蛋白激酶基因对电离辐射抗性没有明显贡献，而dr1243、dr2518、dr2546三个激酶基因贡献于耐辐射球菌的超强电离辐射抗性，其中dr1243则通过调控了RNA修复、体内Fe水平、体内自由基浓度、Mn/Fe比等影响细胞抗性的代谢因素，从而影响了耐辐射球菌的抗性。本研究表明蛋白激酶参与耐辐射球菌抗性，但是其具体机制尚需进一步的研究。

目录

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致谢

摘要

缩略词

1 文献综述

1．1 耐辐射球菌

1．1．1 耐辐射球菌属概况

1．1．2 耐辐射球菌的细菌形态、结构

1．1．3 耐辐射球菌的基因组分析

1．1．4 耐辐射球菌的极端抗性

1．1．5 耐辐射球菌的耐受机制

1．1．6 耐辐射球菌的生物学应用

1．1．7 小结

1．2 蛋白磷酸化／去磷酸化概述

1．2．1 蛋白磷酸化

1．2．2 蛋白磷酸化位点组学研究

1．2．3 蛋白激酶和蛋白磷酸酶的研究

1．2．4 耐辐射球菌中的磷酸化研究概况

2 耐辐射球菌丝氨酸／苏氨酸磷酸激酶家族相关基因突变株的构建

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 菌株

2．1．2 实验试剂、仪器与设备

2．2 菌株培养

2．3 基因缺失突变菌株的构建

2．3．1 突变菌株的构建原理

2．3．2 突变菌株的构建引物设计

2．3．3 耐辐射球菌R1基因组的提取

2．3．4 PCR法获取三段连接

2．3．5 三段连接产物转化耐辐射球菌

2．3．6 突变株的鉴定

2．3．7 突变株的电离辐射处理

2．4 结果和分析

2．4．1 耐辐射球菌中丝氨酸／苏氨酸磷酸激酶基因

2．4．2 突变菌株构建的引物列表

2．4．3 10种丝氨酸／苏氨酸磷酸激酶基因缺失突变株的构建

2．4．4 △dr1243、△dr2518、△dr2546突变菌株对电离辐射很敏感

2．5 讨论

3 耐辐射球菌丝氨酸／苏氨酸磷酸激酶家族基因突变株特性分析

3．1 实验材料与设备

3．1．1 菌株、材料和试剂

3．1．2 仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 生长曲线测定

3．2．2 菌株UV抗性生存曲线测定

3．2．3 菌株H2O2抗性生存曲线测定

3．2．4 菌株辐照抗性生存曲线测定

3．3 结果与分析

3．3．1 突变株△dr1243，较野生株R1的生长出现了延滞

3．3．2 突变株△dr2518，较野生株R1的生长出现了延滞

3．3．3 突变株△dr2546，较野生株R1的生长无显著区别

3．3．4 突变株△dr1243、△dr2518和△dr2546对各种逆境都更为敏感

3．4 讨论

4 耐辐射球菌丝氨酸／苏氨酸磷酸激酶dr1243突变株转录谱分析

4．1．材料与试剂

4．1．1 耐辐射球菌R1的全基因芯片制备

4．1．2 RNA抽提、逆转录、芯片杂交及Q-RT-PCR所用试剂

4．2 实验方法

4．2．1 耐辐射球菌总RNA的分离

4．2．2 芯片探针的制备

4．2．3 芯片预杂交和杂交

4．2．4 芯片扫描及数据分析

4．2．5 实时定量PCR

4．3 结果与分析

4．3．1 在自然生长状态下基因dr1243的缺失导致了众多基因转录水平的下调

4．3．2 在自然生长状态下基因dr1243的缺失导致RNA连接酶DRB0094表达下调

4．3．3 在自然生长状态下基因dr1243的缺失导致Fur蛋白DR0865表达下调

5 总结与展望

参考文献

已发表论文