甘氨酸螯合锌对大鼠肠道锌吸收转运蛋白表达的影响及其吸收机理的初步探讨

摘要

甘氨酸螯合锌是第三代锌源添加剂，具有生物效价高，吸收率高，化学结构稳定等特点。锌作为动物必须的微量元素，通过催化或结构作用参与机体多种酶和蛋白质功能。甘氨酸螯合锌相对于无机锌来说，具有稳定性好，吸收率高，生物利用率高等优点。但其具体的吸收机制尚无定论，本试验通过研究甘氨酸螯合锌和硫酸锌对大鼠肠道锌吸收转运蛋白基因ZnT1，MT1，Zip4，Zip5转录水平和蛋白水平的影响，初步比较两种锌源吸收的差异，并研究两种锌源对小肽吸收蛋白PepT1基因水平和蛋白水平的影响来探讨甘氨酸螯合锌的可能吸收途径;同时通过在日粮中添加不同剂量的甘氨酸螯合锌，探索其对大鼠肠道锌吸收转运蛋白表达影响最显著的剂量，为锌吸收的后续研究奠定基础。
　　 主要研究内容和结果如下:
　　 （一）建立SD大鼠体外灌胃模型，24只21日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠，随机分为3组，分别灌服生理盐水，硫酸锌，甘氨酸锌。2h，6h后乙醚麻醉进行屠宰，取血液，肝脏和肠道组织进行相关试验研究，通过对血清和肝脏锌水平和锌代谢相关酶活性的测定，比较两种锌源的生物学效价，同时采用Realtime-PCR方法研究不同锌源对SD大鼠十二指肠，空肠相关转运蛋白ZnT1，Zip4，Zip5，MT1，PepT1mRNA转录水平的影响，利用蛋白免疫印迹（Western-blotting）方法研究不同锌源对ZnT1，Zip4，Zip5，MT1，PepT1蛋白表达的影响，研究结果显示:
　　 (1)生理生化指标表明:与对照组相比，大鼠灌胃2h，6h后，Zinc-gly可明显提高血清中锌水平(P＜0.05)，Zinc-gly组血清锌水平高于ZnSO4组，但差异不显著，表明Zinc-gly具有较好的吸收效率。肝脏锌水平表明，与对照组相比，两种锌源均可提高肝脏锌水平，但差异不显著。与对照组相比，灌胃Zinc-gly2h后，大鼠肝脏碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，同时高于ZnSO4组，但差异不显著。6h后，Zinc-gly组的肝脏碱性磷酸酶活性显著高于对照组和ZnSO4组(P＜0.05)，这表明甘氨酸螯合锌在提高血清，肝脏碱性磷酸酶活性上效果要显著优于ZnSO4。与对照组和ZnSO4组相比，Zinc-gly可显著提高肝脏Cu-ZnSOD酶活性(P＜0.05)。对于改善血清Cu-ZnSOD酶活性上，两种锌源没有明显差异，且与对照组相比，差异均不显著。
　　 (2)基因水平分析表明:SD大鼠灌胃Zinc-gly后，十二指肠、空肠PepT1mRNA表达量均高于ZnSO4，同时也高于空白对照组(P＜0.05)，但ZnSO4组和空白对照组相比十二指肠，空肠PepT1mRNA水平没有明显的差异。相对于ZnSO4组和空白对照组，大鼠灌服Zinc-gly可显著提高空肠MT1mRNA水平(P＜0.05)，ZnSO4和空白对照相比MT1mRNA水平也有显著的提升（P＜0.05），但在十二指肠中Zinc-gly组和ZnSO4组MT1mRNA水平差异不显著。相对于Zinc-gly组和空白对照组，大鼠灌服ZnSO4可显著提高十二指肠，空肠ZnT1mRNA水平(P＜0.05)，与空白对照相比，Zinc-gly也可显著提高十二指肠ZnT1mRNA水平(P＜0.05)。十二指肠中，相对于ZnSO4组和空白对照组，灌服Zinc-gly可显著提高Zip4mRNA水平，ZnSO4组和空白对照组之间差异不显著。空肠中，ZnSO4组的Zip4mRNA表达量最高，显著高于空白对照组，但与Zinc-gly组间差异不显著。十二指肠中Zinc-gly组Zip5mRNA水平显著高于ZnSO4组和空白对照组，ZnSO4组Zip5mRNA水平显著高于对照组(P＜0.05)，空肠中Zip5mRNA水平显著降低，且Zinc-gly组和ZnSO4组Zip5mRNA水平均低于空白对照组。
　　 (3)蛋白水平分析表明:三个肠段（十二指肠，空肠，回肠）均以Zinc-gly组PepT1表达量最高，其表达量分别为78.1±3.0，42.8±2.1，57.3±2.5;十二指肠中ZnSO4组PepT1表达量高于空白对照组;空肠和回肠中，ZnSO4组和空白对照组间PepT1表达量基本相同。MT1以ZnSO4组的表达量最高，三个肠段的表达量分别为:44.1±1.2，38.4±1.2，82.4±1.9;其次为Zinc-gly组，表达量分别为28.7±1.1，22.6±0.9，30.4±1.0;表达量最低的为空白对照组:表达量分别为:14.8±0.9，19.4±0.7，10.3±0.8。ZnT1的表达量以ZnSO4组的表达量最高，表达量分别为:64.3±1.8，50.5±3.0，95.8±3.3;其次为Zinc-gly组，表达量分别为42.1±2.0，40.6±2.5，48.6±2.5，各个肠段中空白对照组ZnT1的表达量最低。Zip4蛋白的表达量以空白对照组最高，其表达量分别为:74.4±3.3，76.8±3.9，69.0±3.2，其次为甘氨酸锌组，表达量分别为59.1±2.5，58.6±2.0，55.6±2.1。表达量最低的为硫酸锌组，分别为31.3±1.8，33.5±2.5，48.8±1.8。Zip5蛋白的表达量以ZnSO4组表达量最高，分别为58.4±2.0，66.5±2.2，57.8±2.1。其次为Zinc-gly组，表达量分别为:39.2±1.8，35.0±2.6，32.0±2.0。各肠段Zip5蛋白空白组表达量最低，表达量分别为:24.5±1.5，22.8±1.6，26.4±2.9。
　　 （二）30只21日龄SD大鼠（公母各半）随机分为5组，每组6只，饲喂不同剂量的甘氨酸螯合锌纯合日粮，甘氨酸螯合锌添加量分别为23.81，142.86，285.71，571.43，857.14 mg/kg(折算成锌元素分别为5.00;30.00;60.00;120.00;180.00mg/kg)，预饲两天，正饲一周后屠宰取血清，肝脏和肠道组织，通过测定血清和肝脏锌水平以及锌代谢相关酶活性，并采用Realtime-PCR测定ZnT1，Zip4，Zip5，MT1，PepT1mRNA水平，得出甘氨酸螯合锌调控上述基因表达的最佳剂量，研究结果表明:
　　 (1)随着日粮锌水平的不断提高，SD大鼠血清和肝脏中锌水平也不断提高，呈剂量递增关系，第5组和第4组间差异显著，第4组和1，2，3组间差异显著(P＜0.05)，1，2，3组之间差异不显著。肝脏锌水平也随日粮锌水平增加而增加，1，2，3组之间差异不显著，其余各组之间均差异显著(P＜0.05)。血清Cu-ZnSOD酶活性以中间剂量组活性最高，其活性为345.71±18.14 U/mgpro，同时与其他各组之间差异显著(P＜0.05)，肝脏Cu-ZnSOD酶活性以最高剂量组（第五组）活性最高。血清碱性磷酸酶活性以中间剂量组活性最高，与1、2组之间差异显著(P＜0.05)，与4、5组之间差异不显著。肝脏碱性磷酸酶活性以中间剂量组活性最高，与1、2组之间差异显著(P＜0.05)，与4、5组之间差异不显著。
　　 (2)十二指肠，空肠PepT1 mRNA在中间剂量组处表达量最高，显著高于其他剂量组，十二指肠、空肠MT1mRNA水平随日粮锌水平增加而增加。十二指肠中ZnT1mRNA表达量除第2组外，其余各组随甘氨酸螯合锌添加量的增加而递增，第5组ZnT1mRNA表达量最高，第5组与1、2、3、4组间差异均显著(P＜0.05)。空肠中各剂量组之间ZnT1mRNA表达量差异不显著。十二指肠中Zip4mRNA水平随甘氨酸螯合锌添加量的增加而递减，第1组（5mg/kg）Zip4mRNA水平表达量最高，其次为第3组，第2组，第4组，第5组，第1组与其余四组之间差异均显著(P＜0.05)，2、3组;4、5组之间差异不显著。空肠中Zip4mRNA水平也基本呈剂量依赖关系，随甘氨酸螯合锌剂量增加Zip4mRNA水平递减。1、2、3组之间差异不显著，与4，5组之间差异显著(P＜0.05)。十二指肠中间剂量组Zip5mRNA表达量最高，但各组之间差异不显著，空肠中亦是中间剂量组Zip5mRNA表达量最高，1、2、4、5组之间Zip5mRNA水平差异不显著。
　　 上述结果提示:
　　 (1) SD大鼠灌胃试验表明，Zinc-gly在提高血锌水平，改善血清碱性磷酸酶活性，提高Cu-ZnSOD酶活性上效果要优于ZnSO4;基因水平显示，Zinc-gly能更好地刺激PepT1 mRNA表达和蛋白表达，可显著提高空肠MT1 mRNA水平;相对于Zinc-gly，ZnSO4可显著提高十二指肠，空肠ZnT1mRNA水平(P＜0.05)和蛋白水平。十二指肠中，相对于ZnSO4组和空白对照组，灌服Zinc-gly可显著提高Zip4mRNA水平，Zip4蛋白的表达量以空白对照组最高，其次为Zinc-gly组和ZnSO4组。十二指肠中Zmc-gly组Zip5mRNA水平显著高于ZnSO4组和空白对照组。
　　 (2) SD大鼠血清和肝脏中锌水平随着日粮锌提高而不断提高，血清Cu-ZnSOD酶活性以中间剂量组活性最高，同时与其他各组之间差异显著(P＜0.05)，肝脏Cu-ZnSOD酶活性以最高剂量组活性最高;血清和肝脏AKP酶活性以中间剂量组活性最高。十二指肠，空肠PepT1 mRNA在中间剂量组表达量最高;十二指肠中ZnT1mRNA表达量除第2组外也随日粮锌水平增加而增加。十二指肠中Zip4mRNA水平随甘氨酸螯合锌添加量的增加而递减;十二指肠，空肠均以中间剂量组Zip5mRNA表达量最高。

目录

声明

致谢

主要英文缩咯词

摘要

第一章 文献综述

第一节：锌的生物学功能及其在动物营养中的应用

第二节：锌添加剂的发展

第三节：微量元素锌的吸收

第二章 灌胃不同锌源对SD大鼠小肠锌吸收转运蛋白基因水平和蛋白水平的影响

第一节：屠宰和常规指标的测定

1．1 材料和方法

1．2 结果与分析

1．3 讨论

第二节：四种基因的克隆和序列分析

2．1 材料和方法

2．2 试验结果

2．3 讨论

第三节：锌转运蛋白基因的荧光定量PCR

3．1 试验材料与方法

3．2 试验结果

3．3 讨论

第四节：锌吸收转运蛋白的蛋白免疫印迹

4．1 试验材料与方法

4．2 试验结果

4．3 讨论

第三章：不同剂量甘氨酸锌对大鼠锌代谢相关酶活和锌转运蛋白基因水平的影响

1 材料和方法

1．1 试验动物

1．2 试验仪器和试剂

1．3 试验方法

2 试验结果

2．1 不同剂量甘氨酸螯合锌对SD大鼠血清-肝脏生理生化指标的影响

2．2 不同剂量甘氨酸螯合锌对SD大鼠十二指肠，空肠相关转运蛋白mRNA水平的影响

3 讨论

小结与创新点

参考文献