贝氏隐孢子虫Rhomboid基因的生物信息学分析及其核酸疫苗的免疫保护效果研究

摘要

隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种重要的顶复门原虫，主要寄生于宿主的呼吸道和消化道上皮细胞，引起隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)。该病在人、动物和自然界中广泛存在，对免疫功能低下的个体危害尤为严重，常导致持续性腹泻或营养不良，甚至危及生命。目前，对于隐孢子虫病尚无有效防治措施，探索候选靶抗原的结构和功能特性，从而制备特异性抗体和疫苗成为了该领域研究的新方向。
　　本研究将GenBank中发表的C.parvum、C.hominis和C.muris的菱形体蛋白基因序列进行比对分析，设计合成该基因保守片段的1对特异性引物，以贝氏隐孢子虫基因组DNA作为模板，通过PCR扩增出CbROM基因保守片段，采用染色体步移技术获得基因片段3'端和5'端未知核苷酸序列，对所得序列进行测序并拼接。对所获得序列的生物信息学分析表明，该基因的开放阅读框大小为1422bp，编码473个氨基酸，与C.parvum、C.hominis和C.muris的相应基因进行比对分析发现，核苷酸同源性分别为68.2％、66.7％、59.6％，氨基酸序列同源性分别为61.8％、68.6％、51.6％。基因所编码蛋白质的理论分子量为52.7 kDa，等电点为8.65，是疏水性蛋白质，含有7个串连的跨膜螺旋区，无信号肽;该基因含有典型的菱形体蛋白相关保守结构域，属于菱形体蛋白酶家族;功能位点分析结果显示，CbROM蛋白序列包含6个N-糖基化位点，2个cAMP、cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，8个蛋白激酶C磷酸化位点，7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和10个N-豆蔻酰化位点;二级结构中包含α-螺旋38.27％，β-折叠16.70％和无规则卷曲45.03％。
　　以C.baileyi总RNA为模板，结合RT-PCR和巢氏PCR方法，扩增CbROM基因，克隆至pMD18-T Simple载体，测序鉴定序列正确后，经SacⅠ和KpnⅠ双酶切，亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体，构建pEGFP-CbROM真核表达质粒，采用脂质体介导法，将阳性重组质粒瞬时转染入CEF细胞;通过共聚焦显微镜观察和Western-Blot检测，分析CbROM基因在体外表达情况。构建的重组质粒pEGFP-CbROM转染CEF细胞48 h后，在激光共聚焦显微镜下可观察到较强的绿色荧光信号，Western-Blot试验也成功检测到了重组质粒在体外的表达产物，在大小约为80 kDa处出现EGFP-CbROM融合蛋白特异性条带，
　　用已构建的重组质粒pEGFP-CbROM免疫雏鸡，观察其对动物机体诱导产生的免疫应答反应，然后经口接种贝氏隐孢子虫卵囊进行人工感染，评价该核酸疫苗对贝氏隐孢子虫感染的免疫保护效果。结果表明，pEGFP-CbROM核酸疫苗可以使疫苗免疫组动物血清中抗体水平和外周血液T淋巴细胞增殖能力与对照组相比显著提高(P＜0.05)，而外周血液B淋巴细胞增殖能力仅在高剂量(100μg)重组质粒免疫组与不免疫不感染组之间存在显著差异(P＜0.05)。攻虫后，中剂量(50μg)和高剂量（100μg）重组质粒免疫组雏鸡较其他组相比排卵持续时间分别缩短2d和4d，疫苗免疫组之间的增重情况无显著差异(P＞0.05)，但与非核酸疫苗免疫组之间差异显著(P＜0.05)。
　　综上所述，本研究首次获得了CbROM基因全序列，并对其基因特征、理化性质和二级结构等进行预测，成功构建了重组质粒pEGFP-CbROM，并在体外检测到了融合蛋白的正确表达，使用该重组质粒作为核酸疫苗免疫雏鸡，在高剂量（100μg）重组质粒免疫组观察到试验动物对贝氏隐孢子虫感染产生了一定免疫保护性，为隐孢子虫病防治工作提供了新的思路。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一部分 文献综述

第一章 隐孢子虫病研究进展

1 隐孢子虫的流行病学特征

2 隐孢子虫的生活史

3 隐孢子虫感染宿主的发病机理

4 隐孢子虫病的临床表现

5 隐孢子虫病的防治现状

6 小结

第二章 宿主对隐孢子虫感染的免疫应答

1 先天性免疫

2 获得性免疫

3 小结

第三章 菱形体蛋白研究进展

1 Rhomboid蛋白的发现

2 顶复门原虫的菱形体蛋白

3 小结

第二部分 研究内容

第四章 贝氏隐孢子虫Rhomboid基因的克隆和序列分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第五章 贝氏隐孢子虫Rhomboid基因的真核表达

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第六章 贝氏隐孢子虫Rhomboid基因核酸疫苗的免疫保护性试验

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

结论

附录Ⅰ 溶液配制

附录Ⅱ 英文缩写注释

攻读硕士学位期间的主要成果

参考文献

致谢