贝氏隐孢子虫Rhomboid基因的克隆与真核表达

摘要

本研究旨在克隆贝氏隐孢子虫Rhomboid基因,构建真核表达载体,对重组载体在真核细胞中的表达进行了研究.将GenBank中发表的C.parvum、C.hominis和C.Muris的Rhomboid基因序列比对分析,设计合成该基因保守片段的1对引物,以贝氏隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增出CbROM基因保守片段,采用染色体步移技术与生物信息学分析,得到完整的CbROM基因,克隆至pMD 18-TSimple载体,测序鉴定正确后,经SacⅠ和KpnⅠ双酶切,亚克隆至pEG-FP-C2真核表达载体,构建pEGFP-C2-CbROM重组表达质粒；采用脂质体介导法,将鉴定为阳性的重组质粒转染至HEK293细胞；通过荧光显微镜观察,SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测CbROM基因在HEK293细胞中的表达.结果表明,扩增的CbROM基因保守片段长度为359bp,与GenBank中发表的C.parvum Rhomboid核苷酸序列相似性为96％,通过染色体步移技术和开放阅读框预测,获得CbROM基因全长为1422bp;构建的真核表达质粒pEGFP-CbROM转染HEK293细胞24h后,在荧光显微镜下可观察到稳定的绿色荧光信号,SDS-PAGE电泳和Western blotting分析表达融合蛋白的分子量为52 kDa,具有较好的反应原性.结果提示,真核表达质粒pEGFP-CbROM得到成功构建,并能够在HEK293细胞中表达,为进一步研究贝氏隐孢子虫Rhomboid蛋白的生理功能,研发隐孢子虫核酸疫苗奠定了基础.