基于PI3K/AKT/mTOR及AMPK/mTOR双信号通路探讨二甲双胍抗骨髓瘤作用及其机制研究

摘要

背景:
　　多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种单克隆浆细胞异常增生的恶性肿瘤，以产生单克隆免疫球蛋白为特征。目前MM的治疗主要包括传统化疗、新药靶向治疗及免疫治疗等。虽然新的靶向治疗明显提高了MM的疗效，但患者中位生存时间仍在3～5年，普遍存在复发难治现象，MM仍然被认为是一种不可治愈的疾病。因此，进一步研究影响MM细胞生长的相关机制，寻找新的靶向治疗策略，是临床亟需解决的问题。
　　最近，糖尿病与肿瘤的关系受到人们的关注。有研究显示糖尿病与MM亦存在相关性。糖尿病患者存在胰岛素抵抗，导致体内胰岛素(insulin，Ⅰ)及胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）水平升高，而I/IGF介导的PI3K/AKT/mTOR信号通路在肿瘤细胞包括MM细胞增殖及耐药中起重要作用。二甲双胍(Metformin，Met)是一种安全高效的双胍类降糖药，作为胰岛素增敏剂，Met能够通过减少肝糖原异生，增加周围组织对胰岛素的敏感性、抑制肠道细胞吸收葡萄糖发挥降糖作用，有效降低血液胰岛素水平。因此，二甲双胍有可能通过影响I/IGF通路抑制MM细胞增殖。同时，在细胞能量代谢研究中发现，二甲双胍是能量调控信号分子腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的激动剂，激活AMPK负向调控下游哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target ofrapamycin，mTOR）通路可能是其抗肿瘤作用的又一机制。但AMPK在肿瘤中是癌基因还是抑癌基因尚存在争议，其受上游肝激酶B1/丝苏氨酸激酶11(live kinaseB1/serine/threonine protein kinase11，LKB1/STK11)的调控，LKB1/STK11的表达缺失或基因突变所致功能缺失都会影响二甲双胍对AMPK的激活。有关LKB1/AMPK在骨髓瘤中的作用目前仍不清楚。本课题拟探讨二甲双胍对骨髓瘤细胞的作用及其具体分子机制，初步探讨AMPK在骨髓瘤中的作用角色。
　　目的:
　　本研究旨在探讨二甲双胍对骨髓瘤细胞株及原代MM细胞增殖、凋亡、周期阻滞的影响，并寻找其与现有化疗药物的联合作用。在此基础上，明确二甲双胍对PI3K/AKT/mTOR通路及AMPK/mTOR双信号通路的影响，探索二甲双胍抑制骨髓瘤细胞增殖的具体分子机制。进一步利用重症联合免疫缺陷鼠（SCID鼠）构建MM移植瘤小鼠模型，在体内验证二甲双胍及联合用药抗骨髓瘤作用效果。同时，构建敲除AMPK的慢病毒载体转染MM细胞，探讨AMPK对MM细胞生物学行为的影响，初步揭示AMPK在MM中的角色。
　　方法:
　　1.利用MTT法测定二甲双胍对骨髓瘤细胞株细胞及原代细胞增殖的影响，流式细胞仪检测二甲双胍作用后对细胞周期及凋亡的影响。
　　2.MTT法检测二甲双胍与硼替佐米、地塞米松的联合作用，采用Chou-Talalay法判断联合效果，联合指数(combination index，CI)＜1为协同作用，=1为叠加作用，＞1为拮抗作用。
　　3.Western blot及流式细胞仪进一步检测二甲双胍单药及联合用药时凋亡相关蛋白、周期相关蛋白的改变。
　　4.Western blot检测IGF-IR/PI3K/AKT/mTOR及AMPK/mTOR信号通路的改变，加用IGF-Ⅰ(100ng/ml)及PI3K抑制剂LY294002（10μM或5μM）验证。
　　5.皮下注射MM.1S细胞(1×107)构建多发性骨髓瘤移植瘤小鼠模型，在体内验证二甲双胍单药及联合用药效果及对生存的影响。
　　6.构建敲除AMPK的慢病毒载体转染MM细胞，观察其对MM细胞增殖、凋亡及周期的改变，在此基础上加用二甲双胍观察其疗效改变;利用基因测序技术检测肝激酶B1/丝苏氨酸蛋白激酶11基因（lkb1/stk1基因）是否存在突变，初步了解LKB1/AMPK在骨髓瘤中的角色。
　　结果:
　　1.MTT检测发现二甲双胍能够抑制MM细胞增殖，并且呈时间及剂量依赖性，48小时的IC50为5.95 mM到32.18 mM;流式检测发现二甲双胍能够诱导MM细胞凋亡及细胞周期阻滞于G1期，诱导凋亡在MM.1S细胞最明显。10mM二甲双胍处理MM细胞株48h后细胞明显阻滞于G1期，对照组与二甲双胍处理组G1期的比例分别:RPMI8226，28.09±2.40％ vs38.65±2.51％(p=0.0063);MM.1S,52.44±0.89％ vs65.75±3.41％(p=0.0028);MM.1R,50.64±3.17％ vs81.50±2.71％(p=0.0002)。
　　2.MTT检测发现二甲双胍与地塞米松存在联合作用(CI＜1)，而与硼替佐米无联合作用(CI＞1)，进一步利用western blot及流式细胞仪检测验证二甲双胍联合地塞米松或硼替佐米的联合作用，发现二甲双胍与地塞米松在RPMI8226细胞中主要通过周期阻滞于G1期发挥联合作用，而在MM.1S中，主要通过诱导凋亡发挥联合作用。
　　3.Western blot检测周期、凋亡相关蛋白的变化，二甲双胍能够显著激活促凋亡相关蛋白PARP-1，caspase3，caspase9，Bak及G1期阻滞相关蛋白P21，抑制抗凋亡蛋白Mcl-1，HIAP-1，survivin及促G1期进展相关蛋白cyclin D1，CDK4，CDK6;进一步机制研究发现，二甲双胍能够抑制IGF-IR及其下游PI3K的表达，抑制AKT、mTOR的磷酸化，从而抑制下游4E-BP1及p70S6K的激活;加用重组人IGF-Ⅰ(100ng/ml)可以减弱二甲双胍对MM细胞的抑制作用，伴随下游信号通路蛋白的重新激活，加用PI3K抑制剂LY294002（RPMI822610μM，MM.1S5μM）则出现相反的结果。
　　4.Western blot检测结果显示:多株MM细胞株细胞表达AMPK，且呈磷酸化激活状态(pAMPK)，加用二甲双胍能够下调pAMPK的表达。
　　5.皮下注射MM.1S细胞建立MM移植瘤小鼠模型，设立对照组(PBS)。结果发现二甲双胍联合地塞米松较单药组更能明显抑制肿瘤生长，21天后四组瘤体大小分别为4381±1617 mm3，1816±359 mm3，1371±472 mm3和699±268 mm3（p=0.0098）;但二甲双胍单药组小鼠在生存时间上明显优于联合用药组及地塞米松组，四组中位生存时间分别为57.5，82，71和63天(p=0.0048)。
　　6.构建siAMPK的慢病毒转染MM细胞株RPMI8226及MM.1R，干扰AMPK后，细胞增殖减慢，表现为G1期阻滞，但不影响细胞凋亡。进一步对敲除AMPK后的MM细胞株加用二甲双胍干预，结果发现，敲除AMPK后，二甲双胍抑制MM细胞增殖、诱导G1期阻滞及诱导MM细胞株凋亡的效果更明显。
　　7.MM细胞株（RPMI8226及MM.1R）存在lkb l/stk1基因突变导致的353位氨基酸由亮氨酸变为组氨酸。
　　结论:
　　1.二甲双胍能够抑制MM细胞增殖，诱导MM细胞发生凋亡，并使其细胞周期阻滞于G1期。
　　2.二甲双胍与地塞米松存在联合作用，与硼替佐米无联合作用。
　　3.二甲双胍抑制MM细胞增殖通过IGF-IR/PI3K/AKT/mTOR信号通路，加用IGF-Ⅰ能够逆转二甲双胍的抗骨髓瘤作用。
　　4.二甲双胍能够减轻MM移植瘤小鼠的肿瘤负荷，与地塞米松联合效果更明显，但在生存方面，单药二甲双胍组生存时间最长，二甲双胍联合地塞米松用药组不具有生存优势。
　　5.MM细胞株细胞表达AMPK及磷酸化AMPK(pAMPK)，二甲双胍处理后，抑制了MM细胞株细胞AMPK的磷酸化。
　　6.敲除AMPK能抑制MM细胞株增殖，能诱导细胞周期阻滞于G1期，但不影响细胞凋亡;AMPK缺失的情况下，二甲双胍对MM的生长抑制效果更明显。
　　7.lkb1/stk11基因在MM细胞株（RPMI8226及MM.1R）中存在突变，并导致353位氨基酸发生改变，而在MM.1S中无该位点突变，该突变是否影响二甲双胍激活AMPK仍需进一步研究。